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伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)也称为Aujeszky’s disease virus(ADV)或suid herpesvirus type 1,可引发伪狂犬病(PR)。PRV宿主谱广泛,可感染大多数哺乳动物和一些禽类,而高等灵长类动物和人不易感染。猪是PRV的天然宿主,感染的猪群成为PRV的天然储藏器。2012年以来,PR在我国大面积流行,对养猪业造成了巨大的经济损失。因此在养猪业伪狂犬病仍是疾病控制的一个重点,对PRV感染机制进行深入研究具有至关重要的意义。核小体是构成染色质的基本单位,由145-147 bp DNA缠绕着核心组蛋白八聚体构成,相邻核小体之间存在30-40 bp DNA将这种基本结构连在一起。核心组蛋白是由H2A、H2B、H3和H4的2倍体构成八聚体。进化上,核心组蛋白在生物间具有高度的保守性,尤其是H3和H4。1991年,Paul Laybourne和Kadonaga发现核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)与克隆的DNA形成核心核小体,并对基因活性产生温和抑制效应(约为4倍)。部分疱疹病毒感染宿主后,宿主细胞出于自身的防御,将自身组蛋白与病毒基因组组装成染色质结构,从而抑制病毒基因组的复制与转录。已报道的具有上述现象的疱疹病毒有人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人巨细胞病毒(HCMV)和人类疱疹病毒4型(EBV)。目前该现象在PRV感染过程中尚未发现,这为PRV感染机制的研究提供新的方向。染色质免疫共沉淀(CHIP)是一种研究体内染色质环境的方法[1]。CHIP能够在体内捕获与组蛋白H3相互作用的靶基因,精准确定组蛋白H3在体内的特定基因区域,对于研究组蛋白与基因复制、转录的关系具有巨大的应用价值。此方法的建立可为探索PRV感染宿主细胞后,病毒基因组染色质结构与PRV基因组复制的关系奠定基础。基于上述背景,本文开展了以下3个方面的研究,具体内容如下:1.伪狂犬病病毒g E基因SYBR Green 1.实时荧光定量PCR检测方法的建立建立一种快捷、特异、敏感的检测PRV的方法,为后续研究PRV在细胞上的增殖动态提供可靠的检测依据。本试验参照Gen Bank中已登录的PRV Kaplan株的g E基因序列保守区设计一对特异性引物,扩增并克隆目的片段,构建阳性标准质粒,对反应条件进行优化,建立检测PRV g E基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法(qPCR)。同时对该方法的特异性、敏感性及重复性进行验证。结果显示,以重组质粒标准品构建的标准曲线相关系数为0.99,在103-107拷贝/μL范围内线性关系良好。该方法对常见的病毒检测均为阴性,仅对PRV检测为阳性,特异性好。组内和组间变异系数均小于3%,重复性好。本研究建立的PRV g E基因qPCR方法具有特异性强、灵敏度高以及重复性好等优点,可用于后续PRV在Neuro-2a细胞上的增殖动态的研究。2.与组蛋白H3结合的鼠管家基因CHIP-qPCR方法的建立建立与组蛋白H3结合的鼠管家基因GAPDH的CHIP-qPCR方法,为后续PRV染色质状态的研究提供CHIP方法以及内参基因做参考。利用甲醛交联固定Neuro-2a细胞内染色质,超声波破碎将染色质打断成100-500bp的弥散片段后,采用组蛋白H3特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA复合物,再进行解交联,最后纯化DNA。根据参考文献报道的与组蛋白H3结合的鼠GAPDH引物,对免疫共沉淀的DNA样品进行qPCR扩增,验证鼠管家基因GAPDH染色质免疫共沉淀方法建立成功。结果显示,最佳CHIP超声条件为每次超声时间6 s,两次间隔时间9.9 s,功率150 W,总时间20 min。鼠GAPDH-p MD18重组质粒的标准曲线相关系数为0.99,在103-107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。qPCR结果显示Ct=|Ct(鼠GAPDH)-Ct(Ig G)|=11.14,符合CHIP-qPCR条件Ct=|Ct(鼠GAPDH)-Ct(Ig G)|≥3。本研究成功建立与组蛋白H3结合的鼠GAPDH的CHIP-qPCR方法,为后续PRV感染Neuro-2a细胞,病毒染色质的研究奠定基础。3.利用CHIP-qPCR研究与宿主组蛋白H3结合的PRV部分DNA序列与病毒复制的关系首先根据试验一已建立的PRV gE qPCR方法,测定0.1MOI PRV感染Neuro-2a细胞12h内病毒基因组的复制动态。然后收集PRV感染Neuro-2a细胞的样品进行CHIP试验,通过qPCR测定发现PRV部分DNA与组蛋白H3结合形成染色质状态。结果发现PRV部分基因组以染色质结构存在,并对病毒基因组的复制起到抑制作用。本研究成功建立用于研究PRV基因组染色质状态的CHIP试验方法,为感染细胞时PRV裂解细胞的机制研究开辟新的方向,同时为PRV裂解细胞的表观遗传学研究提供依据。