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背景高强度聚焦超声作为一种无创性治疗疾病的新技术,可以治疗包括良、恶性肿瘤在内的多种疾病,疗效已得到广大患者的认可。超声波传播的距离越大,能量衰减越严重,当HIFU治疗较大体积和位置较深的病灶时,疗效并不能令人十分满意。研究者也一直在探索能使HIFU安全高效应用于临床上的方法。增效剂的出现为提高HIFU疗效和安全性带来了希望。研究表明,碘油、微气泡、羟基磷灰石液、包裹液态氟碳的纳米粒等物质均可增强HIFU的消融效果,但这类物质体内滞留时间短,且靶向性不强,在肿瘤及其所在器官内均有这些物质。当用HIFU辐照时,靶区周围的正常组织容易因能量的沉积过多而发生严重的并发症。因而探索滞留时间长、仅到肿瘤组织的HIFU靶向增效剂或方法受到业界关注。双歧杆菌是肠道中常见的益生菌,已被证明是安全无毒的。双歧杆菌的兼性厌氧特性,使其入血液后容易在肿瘤的厌氧区浓聚和繁殖,显示肿瘤靶向性。因双歧杆菌倾向的是乏氧环境,所以对任何具有乏氧环境的肿瘤或者炎症组织均具有靶向性。本研究利用具有高度安全性,且易到达肿瘤乏氧区的益生菌——双歧杆菌的习性,将其作为HIFU增效剂的载体,尝试建立一种新型的HIFU生物靶向增效剂。观察肿瘤靶区双歧杆菌对HIFU增效物质的滞留作用,为该领域的深入研究奠定基础。目的探究肿瘤组织中增殖的长双歧杆菌ATCC15707对CL-NPs(HIFU增效剂)的滞留作用。方法1.培养长双歧杆菌(Bifidobacterium Longum,BF),革兰氏染色观察其形态,Malvern检测仪测量其表面Zeta电位。2.制备包裹全氟己烷的阳离子脂质纳米粒(Cationic lipid nanoparticle,CL-NPs),观察其形态和分散度。Malvern粒径和电位分析仪测出其粒径和表面电位分布,观察温度升高对CL-NPs相变的影响。3.双歧杆菌与CL-NPs的体外连接实验:实验被分为四组,在指定的1-3组培养皿中接种MDA-MB-231细胞,第4组中不接种细胞。待细胞全部贴壁后,分别向1组细胞培养皿中加入CL-NPs,向第2-4组细胞培养皿中加入等量的双歧杆菌。随后,向第3-4组细胞培养皿中加入等量的CL-NPs。10min后,向1-3组的培养皿中分别加入DAPI荧光染料,25min后在共聚焦显微镜下观察各组的连接情况。用流式细胞仪检测第4组中双歧杆菌与CL-NPs的连接率。4.肿瘤组织中的双歧杆菌对CL-NPs的滞留实验:76只荷瘤鼠被随机分为A组和B组(每组38只)。A组(BF+CL-NP组)小鼠经尾静脉注射200μl无菌PBS,B组(CL-NP组)小鼠注射200μl双歧杆菌。7d后,两组小鼠分别经尾静脉注射200μL被荧光标记的CL-NPs。分别于注射CL-NPs后6个时间点(2h,6h,24h,48h,72h和96h),做小动物活体荧光检查,测定肿瘤的荧光强度。注射CL-NPs后48h,从两组中各随机选5只荷瘤小鼠,处死并取出荷瘤鼠的器官(肿瘤,心脏,肾脏,脾脏,肺脏和肝脏),检测各离体器官的荧光强度,送检做冰冻切片,观察不同时间点CL-NPs在肿瘤中的分布情况。最后,将取出的各离体器官组织用甲醛固定,送检做革兰氏染色,以证明双歧杆菌的靶向性。5.双歧杆菌联合CL-NPs增效HIFU疗效的实验:将40只荷瘤鼠随机分为4组(每组10只),前后2次经尾静脉注射不同物质(间隔2天),其中A组(PBS组)2次均注射PBS,B组(双歧杆菌组)分别注射双歧杆菌、PBS,C组(CL-NP组)分别注射PBS、CL-NPs,D组(双歧杆菌+CL-NP组)分别注射双歧杆菌、CL-NPs。第2次注射完成后48h,对荷瘤鼠肿瘤组织行HIFU辐照,分析肿瘤组织灰度变化。于HIFU辐照后1天行组织学检查,测算肿瘤组织凝固性坏死体积和能效因子(EEF),并进行比较。结果1.长双歧杆菌ATCC15707的形态呈蓝紫色长棒状,表面电位为-29mv。2.包裹全氟己烷的阳离子脂质纳米微球(CL-NPs)外观呈乳白色悬液,显微镜下观察呈分布均匀的球形。CL-NPs的粒径分布范围是280±60nm,表面带有38mV正电位。4℃条件下,72h内并未观察到纳米微球的粒径发生显著变化。37℃、40℃、45℃、50℃时,CL-NPs大小保持稳定。当温度升至55℃时,少量CL-NPs体积开始明显增大。3.双歧杆菌与CL-NPs的体外连接情况:CL-NPs通过静电吸附作用在体外不仅可以粘附在表面带负电荷的双歧杆菌表面,还可以粘附在细胞膜的表面。当细胞膜周围存在游离的双歧杆菌时,双歧杆菌表面粘附的CL-NPs的数量明显大于细胞膜上连接的CL-NPs的数量。流式结果显示,比例合适的条件下,双歧杆菌与CL-NPs的有效连接率可达99.9%。4.CL-NPs在荷瘤小鼠体内的分布情况:两组荷瘤鼠肿瘤区域均可观察到红色荧光,但是CL-NP+BF组的肿瘤区域的红色荧光强度大于CL-NP组(P<0.05),CL-NP+BF组的荧光的代谢速率小于CL-NP组(P<0.05)。革兰氏染色显示,BF+CL-NP组的肿瘤组织中有大量的双歧杆菌散在分布,而CL-NP组的肿瘤组织中并未发现双歧杆菌。5.双歧杆菌联合CL-NPs对HIFU的增效作用:D组(HIFU+BF+CL-NP)荷瘤小鼠肿瘤的凝固性坏死体积和辐照前后灰度变化值在所有组中最大,EEF值最小,差异有统计学意义(*P<0.05),且D组荷瘤鼠的肿瘤组织坏死最彻底。结论1.本研究制备的CL-NPs质稳定,大小较均一,表面带有正电荷,温度升高时可使其发生相变。CL-NPs和双歧杆菌能通过静电吸附的方法在体外有效连接,其连接率可达99.9%。2.肿瘤组织中定植生长的双歧杆菌可增加CL-NPs的滞留量和滞留时间;肿瘤乏氧区增殖的双歧杆菌联合CL-NPs能提高HIFU治疗肿瘤的效果。