研究背景心肌肥厚(cardiac hypertrophy)是心脏应对神经内分泌激活以及压力超负荷的适应性代偿反应。在早期阶段,心肌主要通过肌节数目的增多以及体积的增大平衡增大的室壁张力,进而维持心泵输出的稳定以及满足机体生长发育及代谢的需要。如果刺激因素的持续存在,必将发生包括心肌细胞肥大、心肌细胞丢失、间质纤维化等在内的恶性心肌重构(myocardial remodeling)。神经内分泌-细胞因子系统的激活,与心室重构互为因果,形成恶性循环,逐渐进展为失代偿性的心肌收缩功能障碍,即心力衰竭(heart failure)。因此,深入探讨心肌肥厚相关分子学机制,寻找潜在靶点有效干预以及延缓心肌肥厚发生发展对减少心力衰竭发生以及改善预后意义重大。自噬(Autoghagy),是细胞在应激情况下所做出的一种非损伤性应答反应,其通过对自身胞质内物质和(或)细胞器进行包裹吞噬形成自噬体(autophagosome),进一步与溶酶体发生融合形成自噬溶酶体(autolysosome),最终将吞噬物降解。通过自噬,降解产物供给细胞重新利用或排出细胞外,因此对细胞结构、功能以及代谢平衡的维持具有重要意义。在生理情况下,细胞维持一种较低水平的自噬,其主要目的在于清除长寿蛋白和衰老受损的细胞器。当受到各种生理或病理刺激因子的作用时,自噬显著激活。作为一种细胞应对内外环境变化的重要反应机制,自噬降解并清除受损或衰老的细胞器以及错误折叠蛋白,进而稳定细胞形态和结构,维持细胞正常功能以及延缓细胞衰老。此外,自噬还有助于清除入侵的微生物防治感染的发生。既往研究证实,在心肌肥厚的不同阶段,自噬呈动态改变,在疾病进展过程中发挥双重作用。Tanaka等通过构建Lamp-2-/-小鼠,结果发现小鼠心脏与体重的比值明显增大,心肌收缩功能显著降低,同时发现大量自噬泡在横纹肌中的线粒体,肝细胞、胰腺的泡腺细胞内堆积。Nakai等通过特异性敲除Atg5基因构建自噬缺陷小鼠模型,与正常小鼠比较,接受主动脉缩窄术的小鼠更快发展为心室肥大,同时伴有更严重的左室功能障碍。在高血压或其他原因导致的左心室肥厚中,心肌细胞自噬水平显著降低,心肌肥厚进展显著加快。上述研究表明,自噬介导的降解反应对拮抗病理性心肌细胞肥大具有重要意义。此外,自噬缺陷可导致细胞碎片(异常蛋白质和受损线粒体等细胞器)不能被及时清除,继而诱导细胞凋亡(Apoptosis)的发生。研究证实,通过阻止线粒体膜通透性改变,线粒体自噬可有效抑制包括细胞色素C、Caspase等在内的促凋亡因子,发挥拮抗细胞凋亡的作用。因此,以自噬调控作为潜在靶点对心血管疾病的防治具有重要意义。葛根素(Puerarin)是一种从豆科植物野葛根(Pueraria lobata)中提取的黄酮类单体,其化学名称为4’,7-二羟基-8-β-D-葡萄糖异黄酮。众多国内外研究表明,葛根素药效广泛,可应用于肿瘤、糖尿病、神经退行性变以及炎症等多种临床疾病的治疗。在心血管系统中,葛根素具有抑制离子通道、抗血小板活化、抗细胞凋亡以及扩张血管等生物学功能。临床使用葛根素注射液治疗高血压患者,结果发现与安慰剂组患者比较,葛根素治疗可显著降低血压。细胞实验表明,葛根素可通过抗氧化效应抑制血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大,以及H2O2诱导的心肌细胞凋亡。在自噬方面,有限的研究表明葛根素在酒精性肝细胞损伤以及阿尔兹海默病细胞模型中具有自噬调控作用。此外,作为一种植物雌激素,葛根素也可能通过雌激素样作用或雌激素受体发挥对自噬的调控。尽管如此,目前尚无研究探讨葛根素是否通过调控自噬在心肌肥厚中发挥保护作用。因此,在总结既往相关文献的基础上,本研究提出假设：作为一种潜在的自噬活性药物,葛根素可能通过自噬调控在压力超负荷大鼠中发挥减轻心肌细胞肥大和抑制凋亡的心肌保护作用。本研究分别通过腹主动脉缩窄术构建压力超负荷大鼠模型以及异丙肾上腺素刺激H9C2细胞肥大,观察自噬的时序性变化特征。通过葛根素治疗心肌肥大模型,观察自噬以及心肌细胞结构和功能的变化。通过对自噬相关蛋白的基因表达进行特异性干扰,观察对葛根素心肌保护作用的影响,进而对葛根素调控自噬的分子生物学机制进行初步探讨。第一章 葛根素对心肌肥厚过程中自噬的影响目的：分别通过动物和细胞实验,观察自噬在心肌肥厚中的时序性变化特点。在心肌肥厚模型基础上,观察葛根素治疗对心肌细胞自噬的影响。方法：通过腹主动脉缩窄术(aortic banding, AB)构建大鼠心肌肥厚模型,分别在AB术后1w、2w、3w以及6w获取大鼠心肌组织,使用免疫印迹法(Western blot)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ、P62以及Beclinl的时序性表达。将所有大鼠分为4组,即假手术组(Sham组),腹主动脉缩窄术组(AB组),AB组+葛根素治疗组(Pue组,100mg/kg-d腹腔注射)以及AB+雷帕霉素组(Rapa组,1.2mg/kg-d腹腔注射)。治疗3周后分别通过Western Blot和免疫组织荧光法检测自噬标志蛋白LC3、P62以及Beclinl的表达。体外实验给予异丙肾上腺素1μM(ISOpreterenol,ISO)分别刺激H9C2细胞3h、6h、12h及24h,通过Western Blot检测LC3II在ISO刺激下的时序性表达。分别给予Pue(1μM、5μM、10pM以及20μM)预刺激H9C2细胞18h,再给予ISO1μM继续刺激6h,检测并比较不同浓度Pue处理下LC3II的表达。给予氯喹10μM(chloroquine, CQ)预处理H9C2细胞16h,再给予ISO及Pue等处理,通过GFP-LC3转染检测并比较各处理组中的自噬体。结果：LC3II、P62以及Beclinl在Sham组与AB术后1w中比较,差异无显著性。与Sham组比较,AB术后2w及3w,LC3II显著下调(0.04±0.02 vs.0.10±0.02,P<0.01；0.05±0.03 vs.0.10±0.02,P<0.01),P62显著上调(0.37±0.06,vs.0.18±0.04,P<0.01；0.31±0.06 vs.0.18±0.04,P<0,01),Beclin1无显著差异,而在AB术后6w与Sham组比较,LC3II、Beclin1显著上调(0.15±0.03 vs.0.10±0.02,P<0.05；0.36±0.03 vs.0.19±0.02,P<0.05),P62显著下调(0.05±0.03 vs.0.18±0.04,P<0.01)。与AB组比较,AB术后给予Pue或Rapa治疗3周,LC3II表达明显上调(0.23±0.01 vs.0.03±0.01,P<0.01；0.25+0.04 vs.0.03+0.01,P<0.01),p62表达明显下调(0.03±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.01；0.03±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.01)。Beclin1在四组之间的比较无统计学意义。体外实验中,与对照组比较,ISO1μM刺激心肌细胞3h,6h可分别显著下调LC3II表达(0.85±0.04 vs.0.33±0.01,P<0.01；0.81±0.34 vs.0.33±0.01,P<0.01),而刺激12h,24h可分别显著上调LC3II(0.134±0.04 vs.0.33±0.01,P<0.01；0.13+0.06 vs.0.33±0.01,P<0.01)。与ISO组比较,Pue组(5μM、10μM、20μM)可呈浓度梯度依赖性上调LC3II(0.39+0.01,0.53+0.04,及0.96±0.15分别vs.0.19±0.01,P<0.01),而LC3II在Pue(10M)组与ISO组的比较无显著差异(0.22±0.02 vs.0.19±0.01,P=0.69)。通过GFP-LC3转染观察自噬流的改变。与Con组(41.11+11.56)比较,CQ10μM(140.87±28.07)孵育心肌细胞可显著增加自噬体形成(P<0.01)；ISO+CQ(21.21±9.05)共孵育心肌细胞,较ISO组(11.35±4.69)自噬体增加没有统计学意义(P=0.34)；与ISO组比较(11.35±4.69),Pue+ISO组(45.50±6.81)显著增加自噬体(P<0.01),Pue+CQ+ISO组(119.4812.54)较Pue+ISO组自噬体进一步显著增多(P<0.01)。结论：心肌肥厚早期自噬被显著抑制,心肌肥厚后期自噬被显著激活。与雷帕霉素相似,葛根素治疗在心肌肥厚中具有自噬激活作用。第二章 葛根素在心肌肥厚中通过调控自噬发挥心脏保护作用目的：观察葛根素在心肌肥厚中对心肌细胞肥大和凋亡的抑制作用。通过干扰自噬调控,观察对葛根素心肌保护作用的影响。方法：体内实验分为四组：Sham组,AB组,Pue+AB组(100mg/kg.d腹腔注射6周)及Rapa+AB组(1.2mg/kg.d腹腔注射6周)。心脏超声心动图测定心室厚度及收缩功能；处死动物后测量心脏/体重质量比、左心室/体重质量比；苏木精-伊红(HE)染色以及Masson染色评价心肌细胞肥大及间质重构；qRT-PCR检测心肌组织肥大基因ANP、β-MHC mRNA表达。Western Blot险测cleaved-caspase3 (C-Casp3), Tunnel染色检测组织心肌细胞凋亡；体外实验分为对照组(Con)、ISO组(1μM刺激H9C2细胞48h)、Pue组(1μM、5μM、20μM分别与ISO1μM共刺激心肌细胞48小时)。通过鬼笔环肽染色测量心肌细胞表面积,qRT-PCR检测ANP和β-MHC mRNA表达。通过Hoechst33342染色、Western Blot检测C-Casp3评价并比较心肌细胞凋亡。在给予3-甲基腺嘌呤10mM(3-Methyladenine,3-MA)或特异性干扰Atg5基因表达的基础上,Western Blot检测LC3II的表达评价对葛根素调控自噬的影响。通过鬼笔环肽染色测量心肌细胞表面积、qRT-PCR检测肥大基因表达观察对葛根素改善心肌细胞肥大的影响。通过]Hoechst33342染色、免疫沉淀法检测C-Casp3以及Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术评价对葛根素抑制心肌细胞凋亡的影响。结果：与Sham组比较,AB组ANP、β-MHC mRNA均明显上调(8.21±0.48 vs.1.05±0.08,P<0.01；11.26±0.71 vs.1.30±0.27,P<0.01)。与Rapa相似,给予Pue治疗6周,ANP、β-MHC mRNA均较AB组显著下调(1.40±0.28 vs.8.21±0.48,P<0.01；1.47±0.10 vs.11.26±0.71,P<0.01)。术后6周行心脏超声多普勒检查,]LVEF与LVFS在四组之间比较,差异不具有统计学意义。与Sham组(134.78±5.68,215.64±1.14,128.53±4.76,222.32±5.57)比较,左室肥厚指标LVPWd、LVPWs、IVSd以及IVSs在AB组(234.95±9.53,333.62±9.80,199.23±7.42,313.64±16.64)显著增加(P<0.01)。与AB组比较,Pue组LVPWd、LVPWs、IVSs以及IVSd显著减小(152.66±8.37,230.20±3.47,133.89±3.01,246.28±4.71)。HW/BW和LVm/BW在AB组(4.53±0.44,3.18±0.29)与Sham组(2.69±0.16,1.84±0.08)比较均显著增大(P<0.01),在Pue组(3.00±0.38,1.74±0.43)及Rapa组(2.82±0.12,1.97±0.23)分别较AB组显著减小(P<0.01)。病理结果显示,心肌细胞面积及间质纤维化在AB组较Sham组明显增加,在Pue和Rapa组分别较AB组明显减小。Tunel法检测心肌细胞凋亡率,结果表明：与Sham组(0.002±0.001)比较,AB术后6周心肌细胞凋亡率(0.101±0.022)明显增加(P<0.01)。AB术后分别给予葛根素和雷帕霉素治疗,可较AB组明显减少心肌细胞凋亡(0.008±0.002vs.0.101±0.022,P<0.01；0.008±0.002 vs.0.101±0.022,P<0.01)。C-Casp3蛋白表达在AB组(1.20±0.22)较Sham组(0.04±0.02)显著上调(P<0.01),Pue组(0.04±0.01)与Rapa组(0.05±0.01)较AB组显著下调。体外实验结果表明,ANP、P-MHC mRNA水平在ISO组(3.50±0.52,3.98±0.30)中较Con组(0.93±0.22,0.85±0.19)表达显著上调(P<0.01),在Pue (1μM)组与ISO组比较,无显著差异(3.00±0.18 vs.3.50±0.52,P=0.06；3.73±0.33 vs.3.98±0.30,P=0.18),在Pue(5μM及20μM)组中分别较ISO组显著下调。心肌细胞表面积在ISO组较Con组明显增加(703.00±18.57 vs.299.00±26.14,P<0.01),在Pue(1μM)组与ISO组比较无显著差别(683.50±18.72 vs.703.00±18.57,P=0.20),在Pue(5μM,20μ)分别较ISO组显著减小。Hoechst33342检测的细胞凋亡率在ISO组与Con组比较显著增加(0.13±0.02 vs.0.03±0.02,P<0.01),在Pue(1μM)组与ISO组比较无显著差异(0.11±0.01 Vs.0.13±0.02,P--0.34),在Pue(5μM,20μM)组分别较ISO组显著减少。与Pue组比较,3-MA+Pue+ISO组心肌细胞LC3II表达明显下调(0.28±0.17 vs.1.12±0.30,P<0.01)、细胞表面积显著增大(821.87±41.45 vs.392.29±23.42,P<0.01)、ANP及β-MCH mRNA表达明显上调(3.48±0.24 vs.1.36±0.08,P<0.01；4.75±0.37 vs.1.48±0.09,P<0.01)以及心肌细胞凋亡显著增加(Hoechest33342染色：0.15±0.03 vs.0.05±0.03,P<0.01；流式细胞术：16.61±0.77 vs.5.82±0.27,以及C-Casp3:1.56±0.01 vs.0.11±0.03,P<0.01)。进一步使用RNAi技术特异性下调自噬相关基因Atg5,与Control-SiRNA (C-siRNA)中细胞比较,Atg5及LC3II表达分别在SiRNA-Atg5 (Si-Atg5)转染的细胞中显著下调。LC3II表达在Con组(Si-Atg5)、ISO组(Si-Atg5)以及Pue组(Si-Atg5)之间差异无统计学意义。心肌细胞表面积、ANP和β-MCH基因表达以及心肌细胞凋亡分别在Pue组(Si-Atg5)与ISO组(Si-Atg5)比较差异无显著意义。结论：葛根素具有抑制心肌细胞肥大和细胞凋亡的作用。自噬可能是葛根素发挥心脏保护作用的机制之一。第三章 葛根素通过AMPK/mTOR信号通路发挥自噬调控作用目的：观察葛根素在心肌肥大中对AMPK/mTOR信号通路的影响。通过特异性干扰AMPK基因表达,观察对葛根素调控自噬以及心肌保护作用的影响方法：ISO(1μM)分别体外刺激心肌细胞3h、6h、12h以及24h。Pue(1μM、5μM、10μM以及20μM)与ISO(1μM)共孵育心肌细胞6h,western blot检测p-AMPK、自噬标志蛋白LC3以及凋亡蛋白C-Casp3, Hocchest33342染色观察心肌细胞凋亡。通过药物(Dorsomorphin, Dor)或RNAi技术特异性干扰AMPK表达基础上给予Pue (20pM)与ISO (1μM)共培养H9C2细胞,观察对Pue自噬调控以及心肌保护作用的影响。体内实验分别在AB术后1w、2w、3w以及6w观察并比较AMPK激活的时序性变化。通过免疫共沉淀方法检测AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达。结果：在AB术后2w开始,P-AMPK/T-AMPK较Sham组显著下调(0.18±0.04vs.0.49±0.16,P<0.01),但在AB术后6w(0.96±0.11)较Sham组(0.49±0.16)显著上调(P<0.01)。ISO(1μM)分别予体外刺激H9c2细胞3h、6h可分别较Con组细胞显著下调P-AMPK(0.18±0.06 vs.0.93±0.04,P<0.01；0.20±0.05 vs.0.93±0.04,P<0.01),而分别刺激细胞12h、24h则较Con组细胞显著上调P-AMPK(2.22±0.25 vs.0.93±0.04,P<0.01：2.26±0.48 vs.0.93±0.04,P<0.01)。Pue(1μM)预处理心肌细胞24h,再给予ISO1μM共刺激心肌细胞6h,与ISO组比较,P-AMPK表达无显著差异(0.21±0.03 vs.0.22±0.03,P=0.87)。在Pue组(5μM、10μM及20μM)中,P-AMPK分别较ISO组表达显著增加(0.40±0.01 vs.0.22±0.03,P<0.01；0.48+0.03 vs.0.22±0.03,P<0.01；0.48±0.07 vs.0.22±0.03,P<0.01)。Pue治疗3周(0.87+0.06)可较AB组显著上调P-AMPK(P<0.01)。与Sham组比较,AB术后3周P-mTOR(1.55+0.09 vs.0.54+0.02,P<0.01)及下游蛋白P-4EBP1(2.19±0.34vs.1.09±0.018,P<0.01)、P-p70S6K(0.97+0.05 vs.0.33±0.01,P<0.01)表达显著上调；Pue治疗3周后,可分别较AB组显著下调P-mTOR(0.12±0.02 vs.1.55+0.09,P<0.01)及下游蛋白P-4EBP1(0.89±0.10 vs.2.19±0.34,P<0.01)、P-p70S6K(0.09±0.05 vs.0.97+0.05,P<0.01)。与Con组(1.07+0.19)比较,ISO组(0.14±0.11)明显抑制LC3Ⅱ表达(P<0.01)；与ISO组比较,Met组(二甲双胍1mM与ISO共刺激H9C2细胞)或Pue组(20μM共ISO共刺激H9C2细胞)可分别显著上调LC3Ⅱ(1.03±0.23 vs.0.14±0.11,P<0.01；1.20±0.35 vs.0.14±0.11,P<0.01)。与Pue组比较,Dor组(5μM预刺激H9C2细胞4h,再予Pue+ISO共刺激H9C2细胞)可显著下调LC3Ⅱ(0.09±0.08 vs.1.20±0.35,P<0.01),增大细胞表面积(745.75±41.06vs.325.00±12.91,P<0.01),上调ANP(4.08±0.44 vs.1.07±0.29,P<0.01)和β-MHC mRNA(3.99±0.25 vs.0.97±0.17,P<0.01)以及增加细胞凋亡(Hoechst33342染色：0.15±0.03 vs.0.05±0.03,P<0.01；C-Casp3:0.46±0.12 vs.0.09±0.03,P<0.01)。通过RNAi技术特异性下调AMPK表达,LC3Ⅱ在Si-AMPK转染细胞中与C-siRNA转染细胞比较明显下调,在Pue (C-siRNA)与ISO(C-siRNA)中比较差异无显著性。Pue组(Si-AMPK)与Pue组(C-AMPK)比较,LC3Ⅱ显著下调(0.05±0.02 vs.1.51±0.07,P<0.01),心肌细胞表面积显著增大(727.75±71.37 vs.342.50±74.92,P<0.01),ANP(4.18±0.49 vs.0.98±0.15,P<0.01)和β-MCH mRNA(4.03±0.22 vs.0.95±0.24,P<0.01)表达显著上调以及细胞凋亡(Hoechst33342染色：0.13±0.02 vs.0.05±0.03,P<0.01；C-Casp3表达：0.36±0.10 vs.0.09±0.02,P<0.01)显著增加。结论：AMPK/mTOR可能是葛根素发挥自噬调控和心肌保护作用的分子生物学机制。