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目的:探讨磷酸化与SUMO化修饰Spastin及对海马神经元树突棘形态功能以及AMPA受体GluA2转运的调节作用。方法:构建去SUMO化突变体Spastin-K427R原核以及真核表达载体质粒;首先,通过Co-Ip实验验证SUMO化位点,在COS-1细胞过表达鉴定目的蛋白微管切割功能;然后在体外培养原代海马神经元中过表达Spastin-K427R,通过共聚焦成像和全细胞膜片钳检测神经元树突棘形态及突触功能的改变,通过细胞免疫荧光染色明确神经元膜上GluA2数量的变化;最后,通过GST Pull-down和Co-IP实验明确Spastin-K427R与GluA2之间的相互作用以其结合部位。同样,构建去磷酸化Spastin-210A-K427R、拟磷酸化Spastin-210D-K427R原核以及真核表达载体质粒,首先通过GST Pull-down和Co-IP实验明确磷酸化修饰对Spastin-K427R与GluA2相互作用的影响;其次,在体外培养原代海马神经元中过表达磷酸化修饰的突变体,通过细胞免疫荧光染色明确磷酸化修饰后Spastin-K427R对神经元膜上GluA2数量的变化的影响;最后,通过全细胞膜片钳检测明确磷酸化修饰后Spastin-K427R对神经元突触功能的改变。结果:1、在COS-1细胞中过表达Spastin-K427R,细胞免疫荧光结果发现去SUMO化Spastin突变体失去了其微管切割功能,微管结构正常。在体外培养的原代海马神经元中过表达去SUMO化突变体Spastin-K427R,通过共聚焦成像显示树突棘和全细胞膜片钳实验检测AMPAR介导的m EPSC,发现过表达去SUMO化突变体后,树突棘密度增多,成熟型树突棘比例增加,mEPSC的振幅、频率均明显增加(P<0.05)。通过细胞免疫荧光染神经元膜表面GluA2亚基,发现过表达去SUMO化突变体后,细胞膜上GluA2荧光强度明显增加(P<0.05)。2、通过GST Pull-down和Co-IP实验发现Spastin与GluA2在体外和在体内均存在直接相互作用,Spastin-K427R与GluA2的结合明显增加(P<0.05),Spastin的MIT结构域与GluA2的C末端相结合。3、构建去磷酸化Spastin-210A-K427R、拟磷酸化Spastin-210D-K427R载体,通过GST Pull-down和Co-IP实验发现磷酸化修饰增加Spastin-K427R与GluA2在体外和在体内的直接相互作用,去磷酸化修饰减弱了相互作用。在神经元中转染Spastin-210A-K427R、Spastin-210D-K427R,通过全细胞膜片钳实验检测AMPAR介导的mEPSC和细胞免疫荧光染神经元膜表面GluA2亚基,发现磷酸化修饰可促进Spastin-K427R的增加GluA2转运上膜的作用。结论:1、Spastin 427位点去SUMO化后失去微管切割功能,促进树突棘形态、功能成熟,与AMPA受体GluA2相互作用增强,Spastin通过MIT结构域与GluA2的C末端结合,使AMPA受体GluA2亚基转运上膜。2、210位点的磷酸化修饰进一步增强去SUMO化突变体与GluA2的结合,使GluA2上膜增加,AMPA受体功能增强。