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哮喘(Asthma)是一种常见的慢性呼吸道系统疾病，涉及环境因素与遗传因素之间的复杂相互作用，是公认的医学难题，严重威胁着人类的生命健康。然而其生理病理机制至今还没有得到完全地解释。有研究表明，哮喘的病理机制中包括气道重塑(airway remodeling)，气道炎症(Airway inflammation)以及气道高反应性(Airway hyperresponsiveness，AHR)等。目前国际上公认的哮喘可能的发病机制是，气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cell, ASMC)自身生物力学属性发生改变，当受到外界理化因素刺激时，其反应性增强导致气道高反应性与气道狭窄以及随之而来的呼吸功能障碍。因此气道平滑肌生物力学属性变异作为此途径的终极因素成为研究哮喘生理病理机制的重点。近年来，通过定位克隆和全基因组筛查技术确定了去整合素碱金属蛋白酶33(A disintegrin and metalloproteinase33, ADAM33)是一种哮喘易感基因，且发现ADAM33基因与哮喘疾病特征的气道炎症和组织重构具有一定联系。然而与气道炎症同等重要的哮喘气道病理变化是源于ASMC生物力学属性改变所导致的AHR，且已有研究表明ADAM33在哮喘患者气道组织的间充质层包括成纤维层、基底膜和平滑肌层上的表达水平比正常人高。由此认为在哮喘发生发展过程中ASMC的ADAM33蛋白表达与ASMC生物力学属性是否具有一定的相关性、以及ADAM33蛋白的表达是否参与调控ASMC力学特性。为了解决这个问题，本课题采用卵清蛋白(OVA)致敏新生雄性SD大鼠构建哮喘动物模型，在此基础上分离纯化ASMC在体外进行原代培养，研究哮喘病理气道中ASMC的ADAM33蛋白表达水平，及其与ASMC生物力学行为之间的相关性，同时检测在体外调控ADAM33蛋白表达后ASMC细胞生物力学行为的响应，研究两者之间的关系。主要研究内容及结果如下：①研究了不同程度OVA致敏雄性SD大鼠哮喘模型ASMC的ADAM33蛋白表达水平。首先将新生雄性SD大鼠随机分为4组，哮喘组在第1和第7天时注射含1%OVA和10%Al(OH)3的混合盐溶液，第15天起用1%OVA每周雾化3次，分别持续4、6和12周以建立不同程度慢性OVA致敏动物，正常对照组动物用相同的实验方案采取同等剂量的生理盐水处理。从动物模型中分离、获取ASMC并在体外进行原代培养，细胞传代至2-5代用于各项实验。当细胞长至90%融合时，提取总蛋白，将等体积的蛋白溶液加入到10%SDS-PAGE胶中，随后用免疫印记方法(western blot)检测细胞中ADAM33蛋白表达水平，实验结果表明OVA致敏组ASMC中ADAM33蛋白表达水平显著高于对照组(p<0.001)，增加水平在OVA致敏4周时达到最大，致敏6和12周表达水平渐次；②研究了正常与OVA致敏来源的ASMC生物力学属性。从气道的功能来看，ASMC的力学属性被认为是决定哮喘病症之一气道高反应的最终途径。因此本研究综合采取光学磁粒扭转细胞测量仪(Optical Magnetic Twisting Cytometry,OMTC)、傅立叶变换牵引力显微术(Fourier Transform Traction Microscopy,FTTM)、Transwell小室法以及免疫荧光染色技术检测包括细胞刚度和收缩性、细胞牵引力、细胞迁移以及细胞骨架结构蛋白表达在内的细胞力学属性。实验结果表明，与对照组相比OVA致敏组ASMC细胞刚度增加，致敏4周时具有显著性差异(p<0.05)，随后渐次，然而各组细胞对KCl激动剂的响应没有显著性差异。同样，OVA致敏组中ASMC牵引力提高，尤其在OVA致敏4周时具有显著性差异(p<0.05)，随后随着致敏时间的增加有所降低。OVA致敏组ASMC的迁移能力增加，同样的致敏4周时达到最大具有显著性差异(p<0.001)。致敏组ASMC中包括F-actin和Vinculin的细胞骨架结构蛋白的表达较对照组有所提高，特别是致敏4周时，Vinculin的表达具有显著性差异（p<0.001）。③分析了ADAM33蛋白表达水平与ASMC力学属性之间的相关性。实验结果表明，ASMC的ADAM33蛋白表达的变化和ASMC力学属性的改变对OVA致敏具有相同的响应趋势，暗示两者之间似乎具有一定的相关性。通过相关性分析发现ASMC中ADAM33蛋白的表达水平与细胞刚度、细胞牵引力、细胞迁移以及包括F-actin和Vinculin的细胞骨架结构蛋白表达在内的细胞力学属性具有很强的正相关性(Pearson相关系数Cp：分别是0.864，0.716，0.67，0.662，0.774，如表3.1所示)。④研究了调控ADAM33蛋白表达后ASMC细胞力学属性的响应。用上述实验中发现的蛋白表达与力学属性改变最大的OVA致敏4周的ASMC，通过慢病毒转染的办法构建沉默ADAM33蛋白表达的ASMC组，然后检测细胞的力学属性响应。我们的实验结果发现与无处理对照组(4weeks)以及慢病毒转染对照组(GFP)相比，沉默组(pLVT453)细胞的刚度与细胞牵引力都显著下降(p<0.05)。这些结果表明，ADAM33蛋白与ASMC生物力学属性具有很强的正相关性，同时与ASMC力学属性的改变有着直接的联系，并进而在气道高反应性这一哮喘病理因素中发挥关键作用。通过研究ADAM33的表达对ASMC生物力学行为的影响及其内在调控机理，有助于进一步揭示支气管哮喘的发病机制，为探索更好的哮喘病治疗靶点提供科学依据。