核因子-кB(NF-кB)是一种诱导性转录因子，参与众多基因的表达调控，因此与许多疾病密切相关，是目前进行转录治疗和药物筛选的一个重要靶点。NF-кB结合位点的鉴定是发现其靶基因、建立其操纵的转录调控网络的重要基础。NF-кB结合位点的鉴定技术可分为干实验技术和湿实验技术。干实验是基于生物信息学的鉴定技术；湿实验是基于生物实验的鉴定技术。电泳迁移率变动分析(EMSA)技术是一种低通量的湿实验技术，数富集配体系统进化高通量测序技术(SELEX-Seq)是一种高通量的湿实验技术。EMSA技术是检测转录因子结合位点的经典湿实验技术之一，不仅能定性分析转录因子的活化水平，还能定量检测解离常数，验证高通量检测结果。现有的放射性EMSA、化学发光EMSA和双色普通荧光EMSA在实际应用中还存在或多或少的缺点，限制了这些实验技术的日常应用。近年来发展了运用近红外荧光素直接标记DNA进行EMSA检测的近红外荧光EMSA技术，但该技术目前使用成本非常昂贵，探针的合成及修饰费时麻烦。因此，建立一种检测效果良好且成本低的NIRF-EMSA新方法非常必要。　　基于此目的，本论文设计并比较了三种基于Odyssey红外荧光成像系统的EMSA检测方法，即：直接扫胶法、凝胶染色法和扫膜法。通过检测分析HeLa细胞核提取物中转录因子NF-кB的活性，发现扫膜法NIRF-EMSA检测效果好、灵敏度高、性价比高，可以替代传统的EMSA技术。扫膜法NIRF-EMSA的主要实验步骤包括：蛋白与生物素标记DNA的结合反应、反应产物的自然聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶的尼龙膜电转印、尼龙膜的近红外荧光标记链亲合素检测。该实验流程综合了化学发光EMSA和近红外荧光检测的优点，在保证检测灵敏度的前提下，是实验成本降到最低，从而实现NIRF-EMSA的日常化低成本便利应用。　　本论文应用扫膜法NIRF-EMSA技术可以分析NF-кB与不同DNA序列结合的解离常数。在扫膜法NIRF-EMSA实验中，当迁移带与游离带亮度相同时，该泳道中蛋白浓度大小与该序列的解离常数值相等。通过此方法检测了四条经SELEX-Seq筛选得到的DNA序列的解离常数。分析各序列解离常数与SELEX-Seq富集条数之间的相关性，发现通过扫膜法NIRF-EMSA测得的DNA序列的解离常数与富集条数之间呈负相关。证明扫膜法NIRF-EMSA可用于研究转录因子蛋白与DNA的相互作用。　　基于单核苷酸突变双链DNA微阵列芯片获得的亲合性数据，本论文还建立了一种单核苷酸突变矩阵(SNMM)模型，用于分析预测NF-кB与不同DNA序列的结合亲合性，并运用上述NIRF-EMSA实验方法，共同评价和分析SELEX-Seq实验获得的大量DNA序列的结合亲合性，用于鉴定转录因子NF-кB的结合位点。结果表明DNA序列的SNMM评分值与SELEX-Seq实验值呈正相关。通过扫膜法NIRF-EMSA进一步证明SNMM评分值与EMSA实验值吻合。将SNMM评分值高于最佳阈值的DNA序列作为转录因子NF-кB潜在的结合位点，以便进一步从基因组中识别鉴定NF-кB靶基因。　　基于上述的研究，本文利用Odyssey红外荧光成像系统，建立了一种可日常化应用的扫膜法NIRF-EMSA实验方法，并证明该方法可用于测定转录因子与不同DNA序列结合的解离常数，以及用于评价转录因子蛋白对高通量实验筛选的各种DNA序列的结合亲合性，即评价高通量实验的可靠性。