流感病毒是一种小分子RNA病毒，虽然其基因组和蛋白结构非常简单，但是流感病毒的基因变异却显得十分复杂。为了解1995—2006年间深圳市人、禽流感病毒的系统进化规律和分子变异情况，本文利用Simmonic和MEGA等生物信息学软件对178株人流感病毒(71株H3N2、53株H1N1和54株B)和1株高致病性H5N1人禽流感病毒进行了分析比对。研究发现，在这12年间113N2亚型毒株形成了1995—1999和2000—2006两大谱系。谱系内部毒株的进化几乎呈现跳跃的方式，进化速度非常快；2000年后毒株HA1分子上144位糖基化位点的插入、抗原决定簇A、B、D、E和RBS后壁和左侧壁上的变异可能是导致新谱系形成的原因。H1N1亚型病毒的进化不像H3N2亚型迅速，而是有一定的时间连续性，大致形成了4个亚系，亚系间经常发生回复突变；2005—2006年，其HA1分子在抗原决定簇A和B区连续发生了2—3个位点的变异，进而导致了当年H1N1病毒的暴发流行。B型流感病毒被分为Yamagata和Victoria两大谱系，但谱系内部的亚系分支显得较为杂乱，其内部也经常发生回复突变；2005—2006年两谱系同时在人群中流行，这给两谱系间病毒的重组带来了可能；在抗原决定簇位点的变异中Yamagata系比Victoria活跃，但总体上两者的变异方向杂乱无章。在对深圳市首例人感染高致病性H5N1病毒的研究中发现，中和抗体对该H5N1病毒具有良好的拮抗和清除作用；病毒的8个基因片段属于禽源，与2005—2006年我国南方禽类H5N1病毒处在同一个进化分支上；其HA1分子上154位一个新的糖基化位点的插入可能导致其抗原性发生了部分改变，其它内部基因的变异也增加了人类感染的风险。 本研究还建立了一种在单管内同时检测A型、B型、H5亚型和N1亚型流感病毒的多重荧光定量RT-PCR技术。研究首先根据A型、B型、H5亚型和N1亚型流感病毒的相对保守基因通过CLUSTAL W和Primer 3软件分别设计了四套特异性引物和Taqman荧光探针，并通过18株A型人流感病毒(11H3N2，6 H1N1 and 1 H5N1)、5株B型人流感病毒和17株A型禽流感病毒(12H5N1，1 H1N1，1 H3N2，1 H4N6，1 H7N3，and 1 H9N2)对方法进行了特异性检验，结果表明此方法特异性非常好。在此多重检测体系中，四个目标基因的检测灵敏度达到了10<1>-10<2>copies/μl，而且具有很非常好的重复性和稳定性，扩增反应的批间和批内差异为0.13％-4.24％。利用此荧光RT-PCR法在189份临床样本中同时检出81份A型和B型流感病毒阳性样本，其中包括11份N1亚型阳性样本，阳性率42.9％；而传统的培养方法只鉴定出46份阳性样本，中包括5份N1亚型阳性样本，阳性率24.3％。结果说明本研究所建立的多重荧光定量RT-PCR法比传统细胞和鸡胚培养方法要更为灵敏。在流感爆发的季节，本方法对于大规模临床样本的筛查将是一个非常有效的分子诊断工具。 DNA疫苗是上世纪九十年代才建立和发展起来的一门新兴的免疫学理论和技术，在抗病毒、抗肿瘤等许多研究领域均取得了广泛的应用。为了研究流感DNA疫苗对异源流感病毒攻击的保护作用及免疫应答机制，本文将H3N2亚型人流感毒株A/深圳/1/2000的M基因克隆到真核表达载体，构建了pBudCE4.1-M DNA疫苗质粒。通过肌肉注射pBudCE4.1-M DNA疫苗质粒免疫小鼠后，经ELISA分析发现小鼠血清中产生了大量的M1特异性抗体，在致死剂量异型流感病毒 A/PR/8/34(H1N1)的攻击下，疫苗组小鼠获得了67％的存活率，而对照组小鼠全部死亡。通过流式细胞术对免疫后小鼠脾淋巴细胞进行检测，发现疫苗组较对照组小鼠T细胞中CD4+细胞升高而CD8+细胞相对减少；在对小鼠脾淋巴细胞所分泌的细胞因子进行检测中发现，Th1型细胞所分泌IFN-γ和IL-2有显著性增加，而Th2型细胞主要分泌的IL-4没有太多变化，IL-10则有小量增加。因此，这一系列的研究结果表明基于M基因的DNA疫苗对于异型流感病毒的攻击同样具有一定的保护作用；在DNA免疫过程中，CD4+T淋巴细胞在诱导机体的免疫应答中起到了关键的作用，其主要诱导的是以Th1型细胞为主导的细胞免疫应答，而Th2型细胞所参与的体液免疫应答只起到了一定的辅助作用。