全文分为四章： 本文第一章对单分子检测(SMD)的意义作了简单的介绍。SMD技术在生命科学上的应用可以在单分子水平上揭示分子的动态行为、动力学过程和机制，并发现大量分子集合体中分子个体的性质和行为。这项技术已被大量应用于研究细胞外和活细胞内的生物大分子，目前成为深入了解生物体系中生物分子的结构、性质和相互作用等信息的新方法。这一章中我们还对几种在生物大分子SMD中应用较为广泛的技术：全内反射荧光显微术(TIRFM)、激光扫描共聚焦荧光显微术(LSCFM)、近场扫描光学显微术(NSOM)、多光子激发荧光显微术(MPEM)、荧光共振能量转移(FRET)、荧光寿命成像(FLJM)和荧光相关光谱(FCS)等进行了综述。其中对TIRFM的综述已发表在陈宜张、林其谁主编的《生命科学中的单分子行为及细胞内实时检测》一书中(2005年，198-218页，科学出版社，北京)。 第二章中我们发展了一种简单的细胞内荧光显微术。此方法是将激光调节到在细胞上表面发生全内反射，此时激光只照射到细胞内部，减少了噪音，使分辨率大大提高。我们从理论上对这种方法进行了分析，并以实例进行了验证。这种技术相对于已有各种SMD技术能更方便的观测细胞质膜上表面、细胞内部或细胞质膜下表面的单个荧光生物大分子，并可获得高分辨率图像。细胞内荧光显微术具有以下几个显著特点: 1．可在单分子水平上对贴壁细胞上表面观测，弥补了常规全内反射荧光显微术无法观测细胞上表面的缺陷，避免了细胞在贴壁状态固定细胞的玻片对细胞的生命过程造成的不利影响，使得对活细胞生命过程的研究更方便，得到的结果更可靠，甚至可以研究用常规全内反射荧光显微术无法研究的事件。 2．可对细胞内不同位置成像。这种技术只检测细胞内的荧光，而不检测细胞外的荧光。与检测细胞内、外荧光的常规的落射荧光显微术(Epi-FM)相比较，这种技术获得荧光图像的分辨率和对比度更高。 3．对细胞下表面成像也能达到与常规的细胞下表面全内反射荧光显微术相当的分辨率，并能用于细胞下表面的单分子检测。 4．与传统的方法比较，能够快速对细胞不同区域进行观测，这对于研究分子在细胞内的运动及位置变换具有突出的优势。 此部分内容已被Talanta接收，全文已在网上刊登，正待印刷。 第三章中我们以第二章所提出的细胞内荧光显微术，结合落射荧光显微术(Epi-FM)和激光扫描共聚焦荧光显微术(LSCFM)，对活的人正常肝细胞HL-7702中胰岛素受信号转导早期阶段在单分子水平进行了研究。信号分子胰岛素(insulin)与细胞质膜上胰岛素受体(IR)结合可产生一系列生理现象，其早期过程包括质膜上胰岛素与胰岛素受体的复合物(IR-insulin)的运动、聚集以及内涵体的形成等，这些现象在早期曾用形态学、生物化学等方法进行研究，但大多将大量细胞溶解后通过直接测量放射性标记物或荧光标记物的强度进行判断。由于受大量细胞平均化检测方法的限制，无法动态观察这些过程。我们在单分子水平上对细胞质膜上IR-insulin的运动、聚集以及内涵体的形成进行了实时动态研究，观察到如下的一些现象： 1．在实时追踪质膜上IR-insulin的聚集过程时，发现聚集体中含有IR-insulin的个数不均一，有两个IR-insulin复合体同时聚集，也有三个IR-insulin复合体同时聚集；而且聚集体形成过程也不相同。此外，还观察到了质膜上IR先捕获溶液中insulin，然后通过扩散运动与质膜上另一个已形成的IR-insulin复合体聚集，随后又有一分子insulin被质膜上瓜捕获，并且与前面形成的含有两个IR-insulin的聚集体聚集，形成了三个瓜．insulin的聚集体。此实验结果反映出了单个聚集体形成方式的多样性和时间上的不同步性，这在大量分子平均研究中是不能够体现出来的。 2．我们根据荧光强度分析了56个聚集体中含有IR-insulin复合体的个数。发现聚集体中含IR-insulin复合体由2个到14个不等。含IR-insulin复合体个数少的聚集体的数量多，含IR-insulin复合体个数多的聚集体的数量少。并对这些现象的成因进行了解释。 3．在对同一细胞的质膜下表面和上表面聚集体的观察中，发现细胞上表面IR-insulin聚集体较细胞下表面明显多，因为细胞下表面质膜贴壁与玻片接触较紧密，不利于膜上IR的运动，这反映出了单个细胞不同部位受外界影响而产生的不同反应。 4．通过比较胰岛素受体抗体(anti-IR)和insulin与IR的作用，证明了上述所观察到的现象是由于insulin诱导产生的。 上述在单分子水平上的研究的结果描述了在insulin刺激下活细胞上瓜的一些未见报道的生理现象。 在第四章中我们用第二章所提出的细胞内荧光显微术及全内反射荧光显微术(TIRFM)在活体状态下实时观测了人正常肝细胞HL-7702质膜上IR介导的内吞及生成的内涵体。由于研究受体介导入胞的机制对于了解胞内信息传递途径有重要意义，目前已有多种方法用于研究内吞和囊泡运输。如采用电镜或生化方法等来观察到内吞的配体在细胞内的转运途径和获得动力学信息，但是这些方法只能得到静态图片或以破坏细胞结构和囊泡转运系统的完整性来获得大量分子的平均结果。我们则在活细胞状态下进行研究，结果反映出了囊泡间和分子间的个体差异。研究内容主要有几下几方面： 1．观察到了细胞质膜上单个IR-insulin复合体和胞内m-insulin内涵体。通过anti-IR作用于细胞质膜瓜的对比实验，分析了insulin对IR诱导活化作用和细胞对瓜循环代谢过程的两种不同现象，说明了胞内IR-insulin内涵体的生成是由于insulin对IR的活化作用。 2．通过观察囊泡在胞内的运输发现，质膜上单个IR-insulin复合体数量增多后，胞内内涵体才出现。早期内体在近膜区形成后，晚期内体才沿核周围形成。 3．在实时观测IR-insulin聚集体内吞过程中，发现聚集体从质膜表面内吞进入胞内的速度是不均一的，进入胞内的速度是一个由慢到快再到慢的过程。我们从生理过程对这一现象进行了解释。 4．通过对胞内单个内涵体连续观测，还发现内涵体的运动呈不规则变化，但是这些变化均局限在一定区域内，同时这个区域的位置也在随时间变化。对多个内涵体的研究表明，即使在同一细胞内不同内涵体运动也不相同，表现为运动方向、路线和速度等各方面的多样性，这是采用大量平均研究方法所不能体现的。