研究目的:运动是延缓或治疗衰老性肌萎缩最有效的干预手段之一,然而,其潜在的机制尚不清楚。大量的研究发现衰老骨骼肌中存在异常的细胞自噬功能状态,因此,本研究建立了自然衰老大鼠模型以观察运动干预对衰老大鼠骨骼肌萎缩的抑制作用,探讨运动诱导细胞自噬以延缓衰老性肌萎缩的分子机制。并且,构建长期药源性（氯喹）细胞自噬抑制的自然衰老小鼠模型和细胞自噬关键基因Beclin1条件性敲除小鼠模型以探讨运动干预在氯喹抑制细胞自噬功能状态下和Beclin1基因条件性敲除状态下对骨骼肌萎缩的影响,从而论证细胞自噬功能状态在运动干预骨骼肌萎缩中的调控作用。研究方法:1)为了探讨运动干预诱导细胞自噬以延缓衰老性肌萎缩的分子机制,本研究选用6月龄SPF级Wistar雄性大鼠50只自然饲养至21月龄后,随机分为老年对照组（OC组）、跑台运动组（OE组）、爬梯运动组（OR组）、跑台运动和爬梯运动交替运动组（OM组）、自由转轮组（OV组）,每组10只。另外10只6月龄SPF级Wistar雄性大鼠在自然衰老模型构建与运动干预后直接购入作为青年对照组（YC组）。跑台运动最大运动强度为12m/min;爬梯运动采用大鼠尾部负重抗阻爬梯的运动方式,以大鼠体重的20%开始,逐周增加体重的20%直至大鼠体重的60%作为负重量;跑台与爬梯交替运动组采用大鼠跑台与负重爬梯交替进行方式,运动强度与跑台及爬梯运动组相同;自由转轮组采用在转轮中自由饲养方式,总训练时间为12周。2)而细胞自噬功能状态是否介导了运动干预延缓衰老性肌萎缩的机制,接下来本研究观察了在氯喹抑制细胞自噬条件下,运动干预对衰老性肌萎缩的影响。取3月龄SPF级ICR雄性小鼠32只,随机分为老年对照组（OC组）、长期抗阻运动组（LR组）、长期氯喹组（LCQ组）、长期抗阻运动加氯喹组（LCQR组）,每组8只。另外8只3月龄SPF级ICR雄性小鼠在自然衰老模型构建与运动干预后直接购入作为青年对照组（YC组）。抗阻运动采用小鼠尾部负重爬梯的运动方式,以小鼠体重的20%开始,逐周增加体重的20%直至小鼠体重的60%作为负重量;氯喹组和长期抗阻加氯喹组的实验小鼠按照每天40 mg/kg的剂量腹腔注射给药（上午9:00-11:00）,每周五次,对照组、氯喹组及运动组干预时间均为55周。3)为了进一步论证细胞自噬功能状态在运动干预衰老性肌萎缩中的作用,本研究通过构建Beclin1基因条件性敲除小鼠模型探析运动干预对骨骼肌萎缩的影响。取经鉴定后的3月龄SPF级雄性小鼠24只,随机分为Beclin1纯合子不运动对照组(Q+BECN1f/f,QBf/f)、Beclin1纯合子运动对照组(R+BECN1f/f,RBf/f)、Beclin1基因条件性敲除不运动对照组(Q+BECN1c KO,QBc KO)、Beclin1基因条件性敲除运动组(R+BECN1c KO,RBc KO),每组6只。采用小鼠尾部负重抗阻爬梯的运动方式,以小鼠体重的20%开始,逐周增加体重的20%直至小鼠体重的60%作为负重量;训练时间为8周。所有动物完成运动干预周期后,采用腓肠肌重量/体重比值间接评估骨骼肌萎缩状况,HE染色评估骨骼肌组织结构,透射电镜观察骨骼肌纤维超微结构,Western blot检测骨骼肌泛素化相关蛋白Atrogin-1、Mu RF1,细胞自噬相关蛋白Beclin1、p62、LC3,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-C,Akt/Fox O3a信号通路相关蛋白Akt、p-Akt Ser473、Fox O3a、p-Fox O3aSer253,AMPK/PGC-1α信号通路相关蛋白AMPK、p-AMPKThr172、PGC-1α以及线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin和GAPDH蛋白表达水平。研究结果:1)衰老大鼠腓肠肌重量/体重较青年大鼠降低约40%（P<0.001）,而不同形式运动干预均有效延缓了衰老所致骨骼肌质量的下降,其中,跑台运动干预增加了衰老大鼠腓肠肌重量/体重约16%（P<0.05）,爬梯运动增加约28%（P<0.001）,跑台-爬梯交替运动增加约15%（P<0.05）,自由转轮运动增加约21%（P<0.01）,爬梯运动的效果最为明显。HE染色观察到衰老大鼠腓肠肌纤维间隙增大,形状不规则并出现了核居中的现象,肌纤维横截面积较青年大鼠降低约27%（P<0.01）,不同形式的运动干预尤其是爬梯运动组大鼠腓肠肌纤维间隙变小,排列致密,肌细胞形状得到改善,细胞核分布规则,肌纤维横截面积增加,其中,跑台运动组肌纤维横截面积增加约13%（P<0.05）,爬梯运动组增加约23%（P<0.05）,跑台-爬梯交替运动组增加约10%,自由转轮运动组增加约15%（P<0.05）。透射电镜则观察到衰老大鼠腓肠肌纤维排列紊乱,线粒体出现肿胀空泡化现象,而各运动干预组大鼠腓肠肌纤维结构清晰,线粒体形态正常,并观察到自噬小体形成。通过Western blot检测发现,运动干预上调了衰老大鼠腓肠肌低下的细胞自噬水平,改善了腓肠肌细胞自噬通量,并且相应地降低了衰老大鼠腓肠肌凋亡水平,同时抑制了腓肠肌蛋白泛素化。研究还发现,运动干预抑制了衰老大鼠腓肠肌Akt/Fox O3a信号通路,促进了Fox O3a转录活性的提高,同时激活了大鼠腓肠肌AMPK/PGC-1α信号通路,改善了衰老大鼠腓肠肌低下的能量代谢水平,并且通过促进衰老大鼠腓肠肌PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬水平的提高,维持了大鼠腓肠肌线粒体稳态。2)自然衰老小鼠腓肠肌重量/体重较青年小鼠降低约22%（P<0.001）,而长期抗阻运动增加了衰老小鼠腓肠肌重量/体重约12%（P<0.01）,明显延缓了衰老小鼠腓肠肌重量/体重的下降。长期氯喹作用降低了衰老小鼠腓肠肌重量/体重约25%（P<0.001）,加重了衰老小鼠腓肠肌质量的丢失,而长期抗阻运动增加了小鼠腓肠肌重量/体重约22%（P<0.001）,部分改善了氯喹介导的细胞自噬低下所致肌萎缩的影响。HE染色观察到衰老小鼠腓肠肌纤维横截面积较青年小鼠降低约17%（P<0.05）,长期抗阻运动改善了衰老小鼠腓肠肌纤维结构,增加肌纤维横截面积约16%（P<0.01）。长期氯喹组小鼠腓肠肌纤维间隙增大更明显,形状不规则,肌核分布不均,肌纤维横截面积降低约15%（P<0.01）,而长期抗阻运动增加肌纤维横截面积约13%（P<0.01）,改善了氯喹的不利影响。透射电镜观察到长期抗阻运动改善了衰老小鼠腓肠肌纤维结构和线粒体形态,并观察到了自噬小体的出现,而长期氯喹组小鼠腓肠肌纤维排列则更加紊乱,线粒体肿胀程度更大,空泡化现象更明显,长期抗阻运动改善了氯喹诱导的细胞自噬抑制对小鼠腓肠肌纤维的损害。Western blot检测发现,长期抗阻运动改善了衰老小鼠腓肠肌细胞自噬通量,缓解了氯喹对小鼠腓肠肌细胞自噬流的抑制,并且抑制了衰老小鼠腓肠肌细胞过度的凋亡,改善了氯喹通过阻断细胞自噬引起的凋亡的增加。研究还发现长期抗阻运动明显抑制了衰老小鼠腓肠肌蛋白泛素化,并且能够一定程度地缓解氯喹抑制细胞自噬引起的腓肠肌蛋白泛素化水平的提高。同时,研究观察到长期抗阻运动抑制了衰老小鼠腓肠肌Akt/Fox O3a信号通路,提高了Fox O3a转录活性,氯喹在抑制细胞自噬的同时造成了小鼠腓肠肌Akt/Fox O3a信号通路的抑制加剧,进一步提高了Fox O3a的转录活性,促进了对靶基因的调控,而长期抗阻运动干预部分改善了氯喹的影响,降低了对小鼠腓肠肌Akt/Fox O3a信号通路的抑制。研究还观察到长期抗阻运动激活了衰老小鼠腓肠肌AMPK/PGC-1α信号通路,提高了小鼠腓肠肌能量代谢水平,而氯喹在抑制细胞自噬的同时加剧了对AMPK/PGC-1α信号通路的抑制,导致了衰老小鼠能量代谢的恶化,长期抗阻运动改善了氯喹对小鼠腓肠肌能量代谢的不利影响,提高了能量代谢水平。研究还发现长期抗阻运动提高了衰老小鼠骨骼肌PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬水平,而长期的氯喹作用抑制了衰老小鼠骨骼肌PINK1/Parkin信号通路,同时,长期抗阻运动干预改善了氯喹的毒性作用,部分恢复了线粒体自噬水平,维持了线粒体稳态。3)在细胞自噬功能状态正常情况下,抗阻运动增加了小鼠腓肠肌重量/体重约10%（P<0.01）,而Beclin1基因条件性敲除诱导的细胞自噬功能缺陷引起了小鼠腓肠肌重量/体重降低约8%（P<0.001）,诱发了小鼠腓肠肌质量的下降,并且,抗阻运动降低了Beclin1基因条件性敲除小鼠腓肠肌重量/体重约9%（P<0.01）,加剧了肌肉质量的丢失。HE染色观察到,在细胞自噬功能状态正常情况下,抗阻运动增加腓肠肌纤维横截面积约20%（P<0.001）,促进了肌纤维粗大,而在Beclin1基因条件性敲除小鼠诱导的细胞自噬功能缺陷状态下,小鼠腓肠肌细胞形状不规则,核居中现象明显,肌纤维横截面积降低约18%（P<0.001）,出现肌萎缩表征,并且,抗阻运动降低了Beclin1基因条件性敲除小鼠肌纤维横截面积约20%（P<0.01）,进一步加剧了的骨骼肌萎缩。透射电镜观察到,在细胞自噬功能状态正常情况下,抗阻运动促使小鼠腓肠肌纤维排列更加致密有序,线粒体增大,而在Beclin1基因条件性敲除诱导的小鼠腓肠肌细胞自噬功能缺陷状态下,小鼠腓肠肌纤维排列紊乱,线粒体肿胀空泡化明显,并且,抗阻运动加剧了小鼠腓肠肌纤维排列紊乱和线粒体空泡化现象。Western blot检测发现,在细胞自噬功能状态正常情况下,抗阻运动降低了小鼠腓肠肌细胞凋亡,而Beclin1基因条件性敲除诱导的细胞自噬功能缺陷促进了小鼠腓肠肌细胞凋亡,并且发现抗阻运动进一步加剧了小鼠腓肠肌细胞凋亡。同时,研究发现在细胞自噬功能状态正常情况下,抗阻运动降低了小鼠腓肠肌蛋白泛素化水平,而Beclin1基因条件性敲除诱导的细胞自噬功能缺陷引起了小鼠腓肠肌蛋白泛素化水平的增加,并且发现抗阻运动进一步增加了小鼠腓肠肌蛋白泛素化水平,加剧了腓肠肌蛋白降解。研究还发现在细胞自噬功能状态正常情况下,抗阻运动激活了小鼠腓肠肌Akt/Fox O3a信号通路,而Beclin1基因条件性敲除诱导的细胞自噬功能缺陷小鼠腓肠肌Akt/Fox O3a信号通路受到抑制,并且发现抗阻运动加剧了其抑制作用,进一步促进了Fox O3a的转录活性的提高。同时,研究观察到在细胞自噬功能状态正常情况下,抗阻运动激活了小鼠腓肠肌AMPK/PGC-1α信号通路,增强了肌细胞能量代谢水平,而Beclin1基因条件性敲除诱导的细胞自噬功能缺陷小鼠腓肠肌AMPK/PGC-1α信号通路受到抑制,并且发现抗阻运动加剧了其抑制作用,进一步促进了细胞能量代谢水平的降低。研究还观察到在细胞自噬功能状态正常的情况下,抗阻运动激活了小鼠腓肠肌PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬,而Beclin1基因条件性敲除诱导的细胞自噬功能缺陷引起了小鼠腓肠肌PINK1/Parkin信号通路的抑制,并且发现抗阻运动加剧了其抑制作用,进一步破坏了线粒体稳态。研究结论:21月龄Wistar大鼠骨骼肌出现显著的衰老性肌萎缩,然而,12周的运动干预可通过抑制Akt/Fox O3a同时激活AMPK/PGC-1α信号通路,促进衰老大鼠骨骼肌细胞自噬、降低细胞过度凋亡、抑制蛋白泛素化、改善骨骼肌能量代谢及维持线粒体质量控制,延缓衰老性肌萎缩,抗阻爬梯运动可能是对抗衰老性肌萎缩的优化运动干预方式;长期氯喹干预抑制了衰老小鼠骨骼肌细胞自噬通量,导致代谢废物及受损细胞的累积,加重了衰老小鼠骨骼肌萎缩,而长期抗阻运动改善了氯喹对小鼠骨骼肌细胞自噬通量的阻断,缓解了肌萎缩;Beclin1基因骨骼肌条件性敲除所致的细胞自噬功能缺陷导致了小鼠骨骼肌萎缩,抗阻运动加剧了Beclin1基因条件性敲除小鼠骨骼肌萎缩,说明细胞自噬功能状态在运动干预骨骼肌萎缩中起着关键的作用。