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目的:巨噬细胞Coronin-1(冠蛋白-1)与Mtb(结核分枝杆菌)逃逸巨噬细胞的杀伤有关。本研究构建巨噬细胞特异性SP107-C3启动子调控表达Coronin-1 si RNA的p S-EGFP-SP-Coronin-1质粒,研究其特异性敲减巨噬细胞Coronin-1蛋白对RAW264.7小鼠巨噬细胞的吞噬功能及抗耻垢分枝杆菌效应的影响。方法:1.构建pS-EGFP-SP-EGFP、pS-EGFP-SP-Coronin-1重组质粒,分别转染RAW264.7、A549及HEK293细胞,检测其巨噬细胞特异性启动表达si RNA的能力。2.以pS-EGFP-SP-Coronin-1重组质粒转染RAW264.7细胞,用RT-PCR法和Western-blot两种方法检测重组质粒转染前后的RAW264.7细胞Coronin-1的表达水平,明确重组质粒敲减Coronin-1的效率。3.用耻垢分枝杆菌分别感染pS-EGFP-SP-Coronin-1重组质粒转染细胞、pS-EGFP-SP空质粒转染细胞和空白RAW264.7细胞,通过感染细胞内耻垢分枝杆菌菌落总数评估巨噬细胞转染质粒前后对细菌的吞噬能力的影响。4.用细胞爬片抗酸染色法检测细胞吞噬细菌数,电子显微镜观察细胞超微结构变化,流式细胞术检测细胞凋亡水平,进而研究pS-EGFP-SP-Coronin-1重组质粒特异性敲减巨噬细胞Coronin-1对巨噬细胞抗菌效应的影响。结果:1.构建的pS-EGFP-SP-EGFP质粒在巨噬细胞内显著抑制了EGFP的表达,非巨噬细胞的EGFP的表达未受显著影响,表明携带巨噬细胞特异性SP107-C3启动子和EGFP标签蛋白基因的p S-EGFP-SP-EGFP质粒能够作为特异性敲减巨噬细胞目的基因的工具质粒。2.构建的p S-EGFP-SP-Coronin-1质粒敲减RAW264.7细胞的Coronin-1蛋白,且具有巨噬细胞特异性,够显著抑制RAW264.7细胞的Coronin-1的mRNA水平及蛋白表达水平。3.pS-EGFP-SP-Coronin-1质粒转染细胞组在感染耻垢分枝杆菌12h和24h,细胞内细菌数显著高于pS-EGFP-SP空质粒转染细胞对照组和空白细胞对照组(P<0.05)。4.感染耻垢分枝杆菌后,pS-EGFP-SP-Coronin-1质粒转染细胞组溶酶体数量增多,吞噬体和溶酶体有融合现象;感染耻垢分枝杆菌48h后,细胞凋亡水平显著高于对照组细胞(P<0.05)。结论:1.重组pS-EGFP-SP-Coronin-1质粒能够特异性抑制巨噬细胞Coronin-1的表达。2.重组pS-EGFP-SP-Coronin-1质粒可显著促进巨噬细胞吞噬细菌和凋亡杀菌,为研究靶向抑制巨噬细胞Coronin-1的抗结核基因治疗奠定了基础。