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研究背景腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)是治疗终末期肾脏疾病(endstage renal disease, ESRD)的重要替代治疗方法之一。但是,长期暴露于高糖腹膜透析液最终可导致腹膜组织纤维化(peritoneal fibrosis, PF),透析效能降低,最终导致超滤衰竭(ultrafiltration faifure, UFF),严重影响患者的生活质量和长期存活率。近期研究发现,上皮细胞一间充质细胞转分化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是腹膜纤维化过程中的触发和始动因素,它可导致腹膜间皮细胞失去间皮细胞的特点,向成纤维细胞转化,产生大量细胞外基质(extra cellular matrix, ECM),是腹膜功能退化的关键过程。目前认为,在众多调节间皮细胞EMT的细胞因子和介质中,转化生长因子(transforming growth factorβ, TGF-β)是最关键的因素。但是,目前腹膜纤维化的机制仍未完全阐明,且尚无有效的治疗方式。Wnt蛋白是一类富含半胱氨酸的分泌型脂化糖蛋白,参与调控了器官发育,细胞分化增殖,细胞极性以及细胞迁移。Wnt蛋白通过三条信号通路发挥作用,最经典的为P-catenin介导的Wnt/β-catenin信号通路。近年来的研究显示,Wnt/β-catenin信号通路的异常活化与许多疾病,如肿瘤、遗传性疾病和器官纤维化等相关,并已证明其参与EMT的发生。此外,研究证实Wnt/β-catenin与TGF-β信号交互作用,参与介导了TGF-β诱导多种细胞EMT及纤维性疾病的发生过程。基于以上分析,我们认为,Wnt/β-catenin信号通路参与调控腹膜透析腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化的过程。为此,本研究开展如下。第一章腹透流出液间皮细胞Wnt/β-catenin通路活性与EMT的关系研究目的检测腹膜透析患者腹膜透析流出液细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达及EMT发生情况,初步探讨Wnt/β-catenin信号通路与腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化的关系方法随机选取新开管持续不卧床腹膜透析患者12人,腹透一年以上者12人,分离培养并经流式细胞术鉴定透析流出液细胞。通过Realtime-PCR检测流出液细胞Wnt(1,2,3,3a,4,5a,7b,8a,10a), β-catenin, DKK1(Dickkopf1),淋巴样增强结合因子1(Lymphoid enhancer-binding factor1, LEF1),α-肌动蛋白(smooth muscle actin-alpha, α-SMA), E-钙粘蛋白(E-Cadherin),胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ, Col Ⅰ),纤维连接蛋白(Fibronectin, FN),基质金属蛋白酶-7(Matrix Metallo proteinases-7, MMP-7)的表达,Western Blot检测流出液细胞β-catenin, E-Cadherin,α-SMA, COL-Ⅰ的表达。结果(1)腹透流出液细胞经鉴定为腹膜间皮细胞,且细胞形态出现纤维样改变。(2)透析一年以上组α-SMA, Col Ⅰ, FN表达明显高于新开管组,E-Cadherin表达明显低于新开管组(3)透析一年以上组Wntl, Wnt5a, Wnt7b, Wnt8a mRNA表达明显高于新开管组,且β-catenin mRNA及蛋白表达明显高于新开管组(4)透析一年以上组DKK1,LEF1及MMP-7mRNA表达高于新开管组。结论随腹膜透析时间延长,Wnt/β-catenin信号通路活性显著升高,腹膜间皮细胞发生EMT改变,提示Wnt/β-catenin信号通路可能与腹膜透析腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化相关。第二章Wnt/β-catenin信号通路在高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT中的作用目的探讨Wnt/β-catenin在高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT中的作用方法用不同浓度(30,60,90mM)高葡萄糖刺激人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)细胞不同时间点(0,12,24,48h),通过免疫荧光、realtimePCR及western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA、ColⅠ、FN及β-catenin、Wnt1,5a、LEF1的表达；转染DKK1质粒,再予60mM高糖刺激,通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测HMrSV5细胞E-cadherin、α-SMA、Col Ⅰ、FN及β-catenin、LEF1的表达变化。结果高糖刺激后,人腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达降低,α-SMA及Col Ⅰ、FN mRNA及蛋白表达水平升高；β-catenin、 Wnt1,5a、LEF1表达呈时间及浓度依赖性降低。与高糖刺激组相比较,过表达DKK1使β-catenin、LEF1表达下调,E-cadherin表达上调,α-SMA及ColⅠ表达下调；但转染空质粒对高糖诱导的人腹膜间皮细胞β-catenin、LEF1、E-cadherin、α-SMA及ColⅠ的表达变化无明显影响。结论高糖诱导人腹膜间皮细胞Wnt/β-catenin异常活化；过表达DKK1拮抗Wnt/β-catenin信号抑制高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT。第三章Wnt/β-catenin信号在TGFβ1诱导人腹膜间皮细胞EMT中的作用目的探讨Wnt/β-catenin在TGFβ1诱导的人腹膜间皮细胞EMT中的作用方法用不同浓度TGFβi(2.5,5,10ng/ml)刺激HMrSV5细胞,通过免疫荧光、realtime PCR及western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA、 ColⅠ及β-catenin、Wntl,5a、LEF1的表达；转染DKK1质粒及阴性对照空质粒,再予TGFβ1刺激,通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测]3MrSV5细胞E-cadherin、α-SMA、Col Ⅰ及β-catenin、 LEF1的表达变化。结果TGFβ1刺激后,人腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达水平降低,α-SMA及Col Ⅰ mRNA及蛋白表达水平升高；β-catenin、 Wntl,5a、LEF1mRNA表达呈浓度依赖性升高。与TGFβ1刺激组相比较,过表达DKK1使β-catenin、LEF1表达下调,E-cadherin表达上调,a-SMA及ColⅠ表达下调；但转染空质粒对TGFβ1诱导的人腹膜间皮细胞P-catenin、LEF1、E-cadherin、α-SMA及ColⅠ的表达变化无明显影响。结论TGFβ1诱导人腹膜间皮细胞Wnt/β-catenin表达上调；过表达DKK1拮抗Wnt/β-catenin信号抑制’TGFβ1诱导人腹膜间皮细胞EMT。