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研究背景与目的弹性纤维假黄瘤(Pseudoxanthoma elasticum, PXE)，是一种少见的常染色体遗传性疾病，由16号染色体上的ABCC6基因突变引起的，主要累及弹性纤维和结缔组织，造成弹力纤维降解及组织钙化变硬,可侵犯人体多个器官和系统,主要表现为皮肤、眼、心血管系统损害，发病率约为1:50000。迄今为止，共发现ABCC6基因突变近600个。无义突变（nonsense mutation）是指由于某个碱基的改变，使代某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止，肽链合成中断。PXE患者中无义突变的比例近40%,其中R1141X占30%，是主要的致病原因之一，目前缺乏有效的治疗手段。PTC124（Ataluren），是PTC Therapeutics公司生产的小分子药剂，主要通过降低核糖体对早熟终止密码子（Premature Termination codon， PTC）的敏感性，或忽略早熟终止密码子，从而实现对早熟终止密码子的通读（Read-through）。目前PTC124已经应用在治疗遗传性疾病的临床试验中，其中囊性纤维化（CysticFibrosis）已经进入III期临床试验。本实验通过体外研究，观察PTC124对PXE患者早熟终止密码子的通读作用，为临床治疗提供新的思路和办法。研究方法1．体外实验以人HEK293细胞为研究模型在PCMV6-hABCC6-DDK质粒中建立已知的7种不同的早熟终止密码子突变模型，转染至HEK293细胞， PTC124处理72小时，免异荧光染色法和细胞内ELISA法检测早熟终止密码子的通读效率。2．体内实验以斑马鱼为研究模型R1141X是最常见的无义突变，占35%，根据R1141X早熟终止密码子通读后变化的氨基酸序列，在BS/SK-hABCC6质粒中，构建3种可能的错义突变模型，生成相应的mRNA，显微注射入斑马鱼胚胎进行拯救分析实验，观察斑马鱼胚胎的存活率而分析各种错义突变的作用。结果1．体外实验以人HEK293细胞为研究模型实验结果①PTC124浓度在0-40umol/L时无细胞毒性。②对7种无义突变，PTC124可以提高早熟终止密码子的通读效率，浓度在5umol/L时通读效率最高。③PTC124浓度在5umol/L时，R1164X and R1275X的通读效率最高，<8%。④早熟终止密码子的通读效率不仅受药物浓度影响，还受早熟终止密码子后一位氨基酸序列影响，且当+1位置的序列为“C”时最高。2．体内实验以斑马鱼为研究模型实验结果①早熟终止密码子通读后3种可能的错义突变模型，生成相应的mRNA，可以使斑马鱼胚胎正常发育，存活率分别为WT90.6%,TGG73.4%，TGC92.5%，GGA84%,阳性对照组（注射morpholino、R1141X）存活率29%，阴性对照组（注射standard control morpholino）存活率88%，治疗组与mopholino对照组之间有显著性差异（p<0.05）。②3种错义突变模型之间和突变模型与阴性对照组，斑马鱼胚胎存活率无显著性差异（p>0.05）。结论1． PTC124可以提高早熟终止密码子的通读效率，浓度在5ug/mL时通读效率最高；2．早熟终止密码子的通读效率不仅受药物浓度影响，还受早熟终止密码子后一位氨基酸序列影响，且当+1位置的序列为“C”时最高；3．早熟终止密码子通读后3种可能的错义突变，生成相应的mRNA，可以使斑马鱼胚胎正常发育，存活率与对morpholino照组组之间有显著性差异（p<0.05）。4．PTC124对弹性纤维假黄瘤患者有潜在的治疗作用，需要进一步研究