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目的:通过观察单纯缺氧(1%O2)和缺氧/饥饿两种环境下重组人血管内皮抑制素(endostar)及多靶点抗血管生成药物E109(尚未上市的试验药物,因涉及商业保密、以其临床试验的伦理批号后四个字母表示)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)形态、增殖,成管以及迁移能力之作用;观察缺氧环境下两种药物对内皮细胞标志物蛋白水平的影响,并与前期观察到的缺氧环境下单靶点抗血管生成药贝伐单抗(bevacizumab)对HUVEC的作用结果对比,找出三种代表性抗血管生成药对人脐静脉内皮细胞作用的异同之处。方法:选取状态良好的对数期HUVEC进行实验,使用Billups-rothenber细胞缺氧研究装置建立缺氧实验环境,并在此基础上以无血清培养基培养细胞建立缺氧/饥饿环境。观察细胞形态并拍照,通过MTT法检测环境及药物对细胞增殖的影响,并根据MTT细胞增殖实验结果,选择后续迁移及三维培养成管实验中处理时间点及药物浓度。通过Transwell迁移实验、三维培养成管实验分别检测两种环境下E109及恩度对HUVEC迁移、成管能力的影响,通过Western blot检测缺氧环境下E109及恩度作用于HUVEC引起内皮素(endoglin/CD105)及补体应答基因32(response gene to complement-32,RGC-32)表达水平的变化。结果:1、MTT法检测环境处理及环境+药物处理对细胞增殖的影响:缺氧环境、缺氧+1μmol/L、缺氧+4μmol/L、缺氧+6μmol/L经E109处理24小时后,对细胞增殖的抑制率分别为9.54%、26.67%、51.89%及64.42%;相同条件处理48小时后,其对应的抑制率为12.49%、33.61%、54.24%及65.46%。经缺氧/饥饿环境、缺氧/饥饿+1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L经E109处理24小时后,细胞的抑制率分别为10.88%、21.62%、59.87%、66.70%;相同条件处理48小时后对HUVEC细胞的抑制率分别为15.82%、30.99%、65.55%、78.49%。处理24小时后,单纯缺氧、缺氧+10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml及800μg/ml恩度组测得的细胞抑制率分别是8.40%、15.32%、18.02%、21.2%及21.74%;处理48小时后,对应的抑制率为12.50%、12.99%、16.17%、24.37%及24.81%。处理24小时后,单纯饥饿、缺氧/饥饿+10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml及800μg/ml恩度组所测得的细胞抑制率分别是10.19%、17.08%、19.58%、21.92%及23.10%;处理48小时后,对应的抑制率为14.25%、24.03%、29.22%、32.25%及37.59%。依据MTT实验中不同浓度的E109对HUVEC增殖的影响,以抑制率于50%为基准并在低于该抑制率及高于该抑制率所对应的区间内各取一个浓度、力图观察到可能引发细胞生物行为的所有可能浓度,我们选取后期迁移、成管及western blot实验中E109的浓度为1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L;依据MTT试验中不同浓度恩度对HUVEC增殖的影响及药物作用特点,于后期迁移、成管及western blot实验中,将药物原液稀释500倍、25倍、12.25倍及6.125倍(覆盖低浓度到高浓度区间),其对应的浓度值为10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml及800μg/ml。2、HUVEC形态学改变:与正常培养组相比,单纯缺氧、单纯饥饿、缺氧/饥饿处理后,部分HUVEC出现梭状改变、并发出细长丝状伪足。其中单纯缺氧环境培养48小时的细胞之伪足笔直且饱满,单纯饥饿环境培养48小时细胞之伪足末端出现分支结构,而缺氧/饥饿环境培养48小时的细胞之伪足弯曲、纤细。缺氧和缺氧/饥饿两种环境下给1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L E109处理24、48小时后,细胞出现漂浮死亡,存活的细胞伪足明显减少、断裂甚至消失。缺氧和缺氧/饥饿两种环境下给予10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml恩度处理细胞24小时,细胞未见明显漂浮死亡,虽然发出伪足的细胞数目及伪足的长度有所减少,但提高浓度,对伪足的抑制作用并不明显增强。即使经缺氧+800μg/ml恩度处理24小时后,仍有部分细胞能发出伪足。3、HUVEC迁移实验结果:与正常培养组比较,单纯缺氧培养24、48小时组、单纯饥饿培养24小时组及缺氧/饥饿培养24小时组HUVEC迁移能力增强;与单纯缺氧组24、48小时组比较,缺氧+E109(1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L)24、48小时组HUVEC迁移减弱,差异具有统计学意义;与缺氧/饥饿24、48小时组比较,缺氧/饥饿+E109(1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L)处理24、48小时组,HUVEC迁移能力减弱,差异具有统计学意义;与单纯缺氧处理24小时组比较,缺氧+恩度(10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)处理24小时组HUVEC迁移能力减弱,差异具有统计学意义;与缺氧/饥饿24小时组比较,缺氧/饥饿+恩度(10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)处理24小时组HUVEC迁移能力减弱,差异具有统计学意义。缺氧+10μg/ml恩度处理24小时组与缺氧+200μg/ml恩度处理24小时组比较,迁移能力的变化不明显,缺氧/饥饿+10μg/ml恩度处理24小时组与缺氧/饥饿+200μg/ml恩度处理24小时组比较,迁移能力的变化不明显。4、HUVEC成管实验结果:与正常培养组比较,单纯缺氧、单纯饥饿、缺氧/饥饿处理24小时后,HUVEC成管能力未见明显变化,而处理48小时后,其成管能力减弱,差异具有统计学意义。与单纯缺氧培养24、48小时比较,缺氧+E109(1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L)处理24、48小时组HUVEC成管能力减弱,差异具有统计学意义。与缺氧/饥饿处理24、48小时组比较,缺氧/饥饿+E109(1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L)处理24、48小时组HUVEC成管能力减弱,差异具有统计学意义。与单纯缺氧处理24小时组比较,缺氧+恩度(10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)处理24小时组HUVEC成管能力减弱,差异具有统计学意义;与缺氧/饥饿24小时组比较,缺氧/饥饿+恩度(10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)处理24小时组HUVEC成管能力减弱,差异具有统计学意义。缺氧+10μg/ml恩度处理24小时组与缺氧+200μg/ml恩度处理24小时组比较,成管能力的变化不明显。5、缺氧环境下给予HUVEC恩度及E109处理24小时后,细胞CD105及RGC-32表达水平的变化:与正常培养组相比,缺氧培养组CD105表达变化不明显,RGC-32表达水平上升,差异具有统计学意义。而缺氧环境下给予恩度(10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)和E109(1μmol/L、4μmol/L、6μmol/L)处理24小时后,与单纯缺氧组比较,两种药物使HUVEC的CD105和RGC-32表达下降。其中缺氧+E109组CD105和RGC-32表达的水平随着药物浓度的增加而下降。缺氧+恩度组CD105和RGC-32表达的水平下降到一定程度后,随着药物浓度的增加下降趋势并不明显。结论:1、缺氧及饥饿环境不利于HUVEC增殖,抑制其成管能力,但可能促进其迁移能力,缺氧/饥饿环境不利于HUVEC增殖、抑制其成管能力。缺氧环境以及缺氧/饥饿环境下E109及恩度均可影响HUVEC、抑制其增殖、迁移、成管能力;缺氧环境下在一定范围内提高恩度浓度后,对HUVEC迁移、成管能力的抑制效果提高不及E109显著。2、缺氧24小时能够上调RGC-32的表达,但对CD105的表达无明显影响。缺氧环境下给予E109或恩度可使细胞CD105及RGC-32表达水平下降,随着E109浓度的升高,CD105及RGC-32表达的下降愈加明显;在一定范围内随着恩度浓度的提高,CD105及RGC-32表达水平的下降并不显著。3、对比前期工作中缺氧环境下贝伐单抗对HUVEC的生物学行为影响,我们认为恩度及E109在缺氧条件下未出现类似贝伐单抗的促进HUVEC的迁移及成管能力之效应,也没有上调CD105表达。因CD105可能参与了内皮-间质转化过程,据此认为,对处在缺氧环境下的内皮细胞而言,多靶点抗血管生成药物E109及泛靶点抗血管生成药恩度相比单靶点药物贝伐单抗在抑制缺氧条件下HUVEC的恶性生物学行为方面可能更具备优势。在HUVEC中,RGC-32作为一个抑制血管生成的基因,其在缺氧环境下可能发挥着“负反馈”的作用,在缺氧环境下加入E109及恩度后,虽然RGC-32下调,但是由此带来的促进血管生成的效应未能打破在药物强大作用下整个血管生成的平衡,因此细胞的恶性生物学行为依旧被抑制。也从侧面反映了血管生成的平衡是一个复杂的网络,仅凭单一的指标可能无法客观反映整个血管生成平衡的总体变化。