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前言乳腺癌是导致全球女性因癌症死亡的首要原因。目前,对乳腺癌的原发和生长机制还不是很清楚。S100A7是S100家族的成员,S100蛋白家族是一类仅存在于脊椎动物中的小分子酸性蛋白,迄今为止已发现至少20个S100家族的成员,是最大的EF--手相蛋白超家族。多个S100成员在多种肿瘤中表达异常,并与肿瘤的浸润、转移有关,因此S100家族与肿瘤的发生发展关系密切,S100A7最初是从银屑病增生的表皮角质细胞中分离得到的,所以称之为Psoriasin即银屑素。自然情况下S100A7蛋白以同源二聚体形式存在,由101个氨基酸构成的单体分子(11.4kD)组成,特异性趋化CD4+淋细胞和中性粒细胞,参与固有免疫抵挡微生物入侵。S100A7在乳腺癌增生和不典型增生中表达,在侵袭前的原位癌中特别显著。在癌前病变(假淋巴瘤pseudolymphoma)、肺、膀肤、食管、皮肤、口腔等部位的鳞状细胞癌中都存在S100A7显著的异常表达。SLIT是一种由神经胶质细胞分泌的细胞外基质蛋白,在体内对神经元轴突的生长进行导向,在体外与感觉轴突侧支发芽和生长有关。哺乳动物体内的SLIT包含3种亚型即SLIT1、SLIT2、SLIT3,三者均在神经系统表达,后二者还存在于其他细胞中。SLIT2是一组相对分子量为170KD～190KD的细胞外分泌蛋白,其结构域组成包括N端短的信号肽、四个连续的富含亮氨酸的重复序列、九个表皮生长因子样功能区、一个ALPS区域和一个C端富含半胱氨酸的区域。近几年来SLIT2与肿瘤的关系开始受到关注,目前SLIT2在肿瘤中的作用存在争议。03年王等报道SLIT2在多种癌中高表达并且促进血管增生。但最近在多种肿瘤中都发现有抑制肿瘤生长的作用。Anil Prasad等报道SLIT2抑制肿瘤生长是通过调节β-catenin和(PI3K)/AKT途径。S100A7与SLIT2之间的关系,以及他们与ER,PR,HER2,淋巴结转移,血管密度的关系目前还不清楚,所以我们实验目的是用免疫组化,western blot,siRNA,transwell等方法检测S100A7与SLIT2在乳腺癌的表达情况,并且进一步探讨S100A7与SLIT2之间关系,以及S100A7, SLIT2与ER,PR,HER2,淋巴结转移,血管密度的关系,以及S100A7,SLIT2通过AKT途径对乳腺癌生物学功能的改变的影响。材料与方法一、材料1、标本246例乳腺组织取自中国医科大学附属第一临床医院,为2001—2009年手术切除标本。其中乳腺正常组织20例,乳腺浸润性导管癌病变组织226例。乳腺浸润性导管癌按照ER和HER2的阴阳性分为四组。2、细胞系稳定转染S100A7的ER阴性的乳腺细胞系MDA-MB-231 (231-S100A7)和稳定转染vector的ER阴性的乳腺细胞系MDA-MB-231 (231-vector)用含有10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%CO2的培养箱内培养。二、方法1、免疫组织化学检测S100A7, SLIT2在正常乳腺组织和乳腺浸润性导管癌的表达,他们之间的相关性,他们与ER、PR、HER2之间的相关性,以及他们与淋巴结转移,血管密度之间的关系。2、Western blot检测231-S100A7和231-vector比较,SLIT2的变化。检测231-S100A7对AKT的影响,和用siRNA干扰231-S100A7后对AKT的影响。3、Transwell小室检测接种各组细胞分别至Matrigel包被的含有微孔滤膜Transwell小室,分别培养24h后,4%多聚甲醇固定,苏木素染色,显微镜观察细胞体外迁移能力的变化。4、使用SPSS16.0统计软件进行数据处理,以P<0.05为有统计学意义。结果一、S100A7, SLIT2乳腺浸润性导管癌的表达情况1、S100A7在乳腺癌的表达情况(1)S100A7在正常乳腺组织无表达,在乳腺癌中表达较高(35.8%)。(2) ER-PR-组S100A7表达(52.3%)高于ER+ PR+组(21.0%),两者之间差异具有统计学意义(p<0.05),S100A7与ER、PR呈负相关。(3) HER2+组S100A7表达(44.4%)高于HER2-组(27.9%),两者之间差异具有统计学意义(p<0.05),S100A7与HER2呈正相关。(4)ER-组内,HER2+的S100A7表达(62.2%)高于HER2-组(42.5%),两者之间差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)ER+组内,HER2+的S100A7表达(27.2%)高于HER2-组(15.6%),但两者之间的差异无统计学意义(p>0.05)。2、SLIT2在乳腺癌的表达情况(1) SLIT2在正常乳腺组织表达(65%)高于乳腺癌(28.7%),两者之间差异有统计学差异(p<0.05)。(2) ER+ PR+组SLIT2表达(35.2%)高于ER- PR-组(21.4%),两者之间差异具有统计学意义(p<0.05),SLIT2与ER、PR呈正相关。(3) HER2-组SLIT2表达(31.4%)高于HER2+组(25.9%),但两者之间差异无统计学意义(p>0.05),SLIT2与HER2无相关性。(4)ER-组内,HER2-的SLIT2表达(23.5%)高于HER2-组(18.9%),但两者之间差异无统计学意义(p>0.05)。(5)ER+组内,HER2-的SLIT2表达(37.5%)高于HER2-组(32.7%),但两者之间差异无统计学意义(p>0.05)3、S100A7与SLIT2之间的关系经spearman相关分析,S100A7与SLIT2呈负相关,r=-0.133,p<0.05。4、S100A7,SLIT2与淋巴结转移的关系(1)有淋巴结转移组S100A7表达率高于无淋巴结转移组,两组间的差异有统计学意义(p<0.05),提示S100A7促进淋巴结转移：(2)无淋巴结转移组SLIT2表达率高于有淋巴结转移组,两组间的差异有统计学意义(p<0.05),提示SLIT2抑制淋巴结转移。5、S100A7,SLIT2与微血管密度之间的关系(1)乳腺浸润性导管癌中,经spearman相关分析,S100A7与血管密度呈正相关(r=0.430,P<0.05),经t值检验S100A7阳性表达的微血管密度明显高于阴性表达的微血管密度,两者之间的差异有统计学意义(P<0.05)。(2)乳腺浸润性导管癌中,经spearman相关分析,SLIT2与血管密度负相关(r=-0.157,P<0.05)。经t值检验,SLIT2阴性表达的微血管密度明显高于阳性表达的微血管密度,两者之间的差异有统计学意义(P<0.05)。二、Western blot方法检测S100A7与SLIT2的调控关系(1)231-S100A7与231-vector相比,231-S100A7细胞系SLIT2的表达量下降,提示S100A7下调SLIT2。(2)在EGF诱导下,231-S100A7,p-AKT表达上调,总AKT的表达量基本无变化。用siRNA干扰231-S100A7,p-AKT表达量下降,总AKT的表达量基本无变化。提示在EGF诱导下,S100A7介导AKT途径。三、S100A7对生物学行为的影响Transwell迁移试验我们用不同浓度(0 ng/ml,50 ng/ml,100 ng/ml,150 ng/ml, 200 ng/ml)的S100A7刺激231-S100A7细胞和231-vector细胞,发现随着浓度的增高乳腺癌细胞的迁移能力增强,尤其是50 ng/ml时,最显著(P=0.0006),提示S100A7促进乳腺癌细胞的迁移。结论1、S100A7在乳腺癌中高表达；与ER、PR负相关；与HER2正相关；促进淋巴结转移；与浸润性导管癌的微血管密度呈正相关。2、SLIT2在乳腺癌中低表达；与ER、PR正相关；抑制淋巴结转移；与乳腺浸润性导管癌的微血管密度呈负相关。3、S100A7与SLIT2之间呈负相关4、在乳腺癌细胞中S100A7可能通过抑制SLIT2来上调AKT途径促进乳腺癌细胞的迁移。