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乌龟(Mauremys reevesii)是典型的具温度依赖性性别决定(TSD,Temperature-dependent sex determination)机制的物种,当受精卵孵化温度在32℃时,子代全为雌性;孵化温度在26℃时,子代全为雄性;孵化温度为29℃时,子代雌、雄比例约为1:1。迄今,有关TSD的分子机制研究成果丰硕,然而,具TSD的物种是否具有性染色体的分化一直存有争议,且外界信号究竟如何影响性别关键基因的表达尚不清晰。本文以乌龟为研究对象,采用性腺发育的形态学观察、RNA干涉、表观遗传分析、高通量测序等分子生物学技术研究了其性别决定系统和性腺早期发育与成体功能维持的表观遗传。主要研究结果如下:1.采用三个温度梯度孵化受精卵,鉴定胚胎发育温度敏感期性腺形态特征。通过雄性孵化温度(male producing temperature,MPT,26℃)、雌性孵化温度(female producing temperature,FPT,32℃)和关键温度(Pivotal temperature,PvT,29℃)下的乌龟受精卵孵化实验,比较结果显示胚胎性腺发育始于第15期,15期至21期雌、雄性腺发育并无明显差异,根据前人的研究,确定15期至21期为性腺发育温度敏感期。雌雄性腺发育在第23期开始出现不同的发育特征:雄性性腺呈椭圆形;而雌性性腺呈细长形,并伴有输卵管的分化,显示性腺已经分化完全。2.采用分子性别鉴定方法,研究了乌龟性别决定系统。乌龟雌雄个体来自本实验室PvT下孵化的四年龄龟,采用荧光定量PCR(qPCR)的方法比较18个与性染色体有关基因(ADARB2、ATP2A2、ENOX2、LPAR4、GPATCH8、CCDC92、MED13L、SP4、PEBP1、GAD2、ITGB1、ARMC4、DMRT1、SOX9、AMH、CYP19A1、WT1和SF1)的雌雄拷贝数差异,以中华鳖(ZZ/ZW型)为对照组,结果表明其中17个基因的雄性拷贝数是雌性的2倍,推测它们位于Z染色体上,有1个基因的拷贝数是1:1,推测其位于常染色体上。采用荧光原位杂交技术(FISH)对PvT孵化的子代性别决定相关基因AMH和WT1进行验证,结果显示在雄性个体中均存在2个杂交信号;而雌性个体中仅有1个杂交信号,首次证实乌龟为ZZ/ZW型性别决定系统。乌龟为典型的具TSD机制物种,后代性别比仍然受到温度的调控,推测乌龟虽有性染色体分化,但性别决定主要受到表观遗传的影响,其性别决定机制可能为GSD+TE类型。3.性腺发育温度敏感期DNA甲基化对性别决定相关基因表达的影响。采用亚硫酸氢盐修饰测序法比较分析了乌龟胚胎MPT和FPT的17期、19期和21期性腺性别相关基因(CYP19A1、FOXL2、DMRT1、SOX9和AMH)近端启动子区的DNA甲基化水平,同时采用qPCR技术检测了5个性别相关基因的mRNA表达水平。结果表明性别相关基因的mRNA表达水平与启动子区的CpG甲基化状态呈极显著负相关(CYP19A1:r=-0.98,P<0.001;FOXL2:r=-0.95,P<0.01;DMRT1:r=-0.87,P<0.001;SOX9:r=-0.82,P<0.01;AMH:r=-0.94,P<0.001)。CYP19A1和FOXL2的表达水平在FPT下显著高于MPT(P<0.0001),DMRT1、SOX9和AMH的表达水平MPT下显著高于FPT(P<0.0001)。本研究还采用qPCR技术检测了MPT、PvT和FPT性腺的17期、19期和21期的DNA甲基化酶基因(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2和TET3)以及组蛋白去甲基化酶基因(KDM5B、KDM1A、KDM6B、KDM8、KDM3B、NO66、JMJD6和PHF2)的mRNA表达。结果表明,NO66和KDM6B的表达随温度上升显著下降(P<0.0001),且NO66和KDM6B的表达量与雄性性别相关基因DMRT1、SOX9和AMH的表达量极显著正相关(NO66-DMRT1:r=0.96,P<0.001;NO66-SOX9:r=0.87,P<0.001;NO66-AMH:r=0.9,P<0.001;KDM6B-DMRT1:r=0.94,P<0.001;KDM6B-SOX9:r=0.85,P<0.01;KDM6B-AMH:r=0.88,P<0.001)。该结果提示组蛋白去甲基化酶基因KDM6B和NO66均受到温度调控表达,它们的组蛋白去甲基化作用可促进雄性性腺发育。鉴于KDM6B基因的作用前人已经阐明,因此NO66基因如何发挥作用值得进一步研究。4.组蛋白去甲基化酶基因NO66对乌龟胚胎性腺发育的影响。采用携带NO66 mRNA特异性shRNA的慢病毒载体转染乌龟第14期胚胎,成功构建了NO66基因表达敲低模型。NO66的低表达能导致乌龟MPT胚胎雌性化。与对照组相比,第21期胚胎中,DMRT1基因启动子区甲基化程度显著上调(P<0.001),而表达量显著下调(P<0.001),DMRT1下游基因SOX9和AMH的表达量显著下调(P<0.001),而CYP19A1和FOXL2的表达量显著上调(P<0.001),但KDM6B的表达并没有显著降低。该结果提示,去甲基化酶基因NO66也可通过调控雄性性别发育关键基因DMRT1基因的表达,促进雄性性腺发育,推测其作用或是在KDM6B的下游,或是两者共同发挥作用。由于NO66和KDM6B基因双敲模型胚胎致死率过高,难以获得有效证据,需要采用免疫共沉淀等技术进一步验证NO66和KDM6B之间相互关系。5.高通量转录组测序比较睾丸和卵巢组织mRNAs和miRNAs的差异表达。通过比较转录组学分析,筛选了差异表达基因(DEGs,differentially expressed genes),KEGG分析了与性腺维持相关的通路,推测了性别决定基因分子信号级联调控网络。本文还同时注释和分析了乌龟的miRNA及差异表达特征,并预测映射到相应靶基因。基于miRNAs和靶标基因调控网络,着重进行了性别决定相关基因靶标富集分析,初步构建了乌龟成体性腺配子发生和功能维持的关键分子机制和调控网络。本研究以具TSD机制的乌龟为对象,首次证实了乌龟具有ZZ/ZW性别决定系统,推测其性别决定机制可能为GSD+TE类型;探究了表观遗传对胚胎早期性腺发育的影响和在成体性腺功能维持的作用;采用基因操作技术,证明了NO66对MPT胚胎性腺发育的促进作用。本研究提供了表观遗传调控TSD的直接证据,对深入研究TSD的分子机制具有重要的科学意义。