研究背景酗酒在全世界范围内作为一种习惯而普遍存在,其影响和危害目前已被公认。酗酒已经成为全球范围内疾病和残疾的第三大诱因,导致最常见的症状是慢性酒精中毒,其可能诱发多达60多种疾病,不仅对个人的身体健康有很大影响,同时亦造成严重的社会后果。狂欢性饮酒作为普遍流行于男性年轻人群体中的一种特殊的饮酒模式,同长期慢性饮酒模式共同参与了多数酒精性肝病的发生发展过程中,但其作用机制仍有待深入。酒精通过激活氧化应激反应诱导氧族与氮族自由基增多,是酒精性肝细胞损伤的重要作用机制之一。这一过程中大量产生的自由基:超氧阴离子（02-）、过氧化氢（H202）、羟自由基CO（OH-）、一氧化氮（NO）和乙氧自由基（C2H50-）等,不仅激活磷脂酶及脂质过氧化反应,还影响遗传物质和蛋白质的结构及功能造成肝细胞损伤。此外,NO对线粒体呼吸的抑制作用对肝脏代谢具有重要影响。NO和O2-结合产生的过氧亚硝酸基阴离子（ONOO-）,是一种强氧化剂和细胞毒性物质,能够直接引起细胞的损伤与凋亡。研究表明NO主要是通过三种一氧化氮复合酶（eNOS、nNOS和iNOS）诱导产生,而NOS的生物结构中存在Caveolin-1（Cav-1）结合基序（OXOXXXXO,or OXXOXXXXO）,能够被 Cav-1 的脚手架结构蛋白（Caveolin-scaffolding domain,CSD）结合。Cav-1作为NOS的重要调控蛋白,在氮自由基损伤的发生发展过程中起到重要作用。Cav-1,是小窝膜上重要的一个结构蛋白（21-24 KD）,调节细胞生长、细胞凋亡和胆固醇转运等生理功能。它可以通过与NOS直接结合的方式调节三种类型的NOS。研究表明,Cav-1基因敲除小鼠的心脏中eNOS和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白水平均显著性上调。我们的研究团队先前已报道在神经细胞中Cav-1和NO之间的负相关调控机制。目前,关于Cav-1在其他肝脏疾病中有一定的研究,但是在酒精性肝损伤,特别是由不同的饮酒习惯所导致的损伤发生发展的机制中,Cav-1的病理生理作用仍有待深入探究。现代新药的发现竞争的焦点在于靶点的发现与证实以及供筛选的库,传统中药由于拥有几千年长期临床经验的积累,在新药的研究中拥有广阔的前景,如何在庞大的中药资源中筛选出有针对性和特异性的中药成分,并结合生物靶点的研究基础去探究中药靶标治疗的理念,或许能促进中医药理论的进一步深化,并为中医药在全球的进一步推广提供科研依据。在这项研究中我们通过体内动物实验（基因敲除小鼠）、体外细胞实验以及人体临床实验深入探索了 Cav-1在急慢性饮酒引起的肝损伤发生发展的作用机制。为Cav-1在狂饮过程中以及长期慢性饮酒诱导肝损伤中的作用提供了理论基础和临床依据。同时我们尝试筛选出针对Cav-1调控的特异性中药单体,为中药靶标治疗理念在酒精性肝损伤的治疗和运用提供分子生物实验依据。研究方法:1.动物实验本课题中动物实验方案由香港大学动物伦理中心批准。同窝对照的雄性Cav-1 基因敲除小鼠(Cav-1^-/-mice,strain Cav-1tmlMls/J,Jackson Laboratory,USA),Cav-1基因杂合子小鼠(Cav-1^+/-)以及野生型正常小鼠（WT,Cav-1+/+）鉴定后在8-12周龄被用于模型建立。1.1.急性狂欢性饮酒动物模型建立狂欢性饮酒（Binge drinking,狂饮或豪饮）模型:小鼠禁食不禁水6h后,用50%（vol/vol）酒精按照饮酒总量5g/kg体重的剂量灌胃。对照组以等体积的水溶液灌胃。平行干预实验中,在狂饮模型建立的30分钟前给予小鼠iNOS抑制剂 N-（3-（Aminomethyl）benzyl）acetamidine（1400W;5 mg/kg,ip.）。1.2.慢性酒精性肝损伤动物模型建立将6-8周的雄性野生型及Cav-1^-/-小鼠喂养Lieber-deCarli液体词料,3天后随机分为四组:野生型小鼠对照液态饲料喂养组和酒精液态词料喂养组;Cav-1^-/-小鼠对照液态饲料喂养组和酒精液态词料喂养组。酒精组小鼠喂养梯度浓度的酒精,1%和2%（vol/vol）各自喂养2天,3%喂养3天,而后5%酒精喂养7周。对照组全程喂养等卡路里液体词料。1.3.慢性酒精性肝损伤动物模型柚皮苷处理组小鼠慢性酒精性肝损伤模型建立第3周后开始以200mg/kg/d的剂量对小鼠流质饮食中添加柚皮苷,持续4周。1.4.实验动物样品制备各组小鼠模型完成后,用200mg/kg戊巴比妥麻醉小鼠,经心脏采血,分离血清,-80℃保存备用,用于检测血清Cav-1水平、谷丙转氨酶和谷草转氨酶（ALT/AST）、NO水平、NOS 水平（总复合酶活性及iNOS活性）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（Catalase）活性、谷胱甘肽（GSH）活性及表达、游离脂肪酸（Free fatty acids,FFA）及甘油三酯（Triglycerides,TC）水平。然后通过心脏灌注将小鼠体内的血液排除,取出小鼠肝脏,观察其大体形态,并于肝左叶中部取新鲜肝组织4%PFA固定后行病理切片处理（冰冻切片和石蜡切片）,HE染色及各种免疫组化检测,观察肝脏组织病理学变化,同时检测肝组织中Cav-1及相关蛋白的表达,以及用TUNEL检测肝细胞凋亡情况;同时取相邻部位肝组织肝组织匀浆,用于免疫印迹实验（Western blot）,检测肝组织中Cav-1及相关蛋白的表达改变,同时检测肝脏中一氧化氮复合酶水平、ADH、Catalase、GSH及SOD活性;另取一部分肝组织液氮速冻后保存,以提取小鼠肝脏总RNA,用于逆转录-聚合酶链反应及Real-time PCR反应检测Cav-1、炎症因子的mRNA水平。1.5.ONOCT荧光探针实验COMPOUND 14（专利号:WO2013113279A1）,是由香港大学化学系最新研制成功的一种针对ONOO-特异性结合的红色荧光探针,具有极其强烈的探测ONOO-敏感性及选择性。小鼠狂饮模型建立后3h,对麻醉后的狂饮小鼠肝脏进行 ONOO-探针溶液 COMPOUND 14（1 mM/mice liver;Perfusion rate:2 ml/min,total25 ml）的灌注后,急速冷冻做成冰冻切片,荧光显微镜下观察并记录。2.细胞实验人源正常肝细胞株L02购自中山大学动物实验中心细胞库。常规培养传代后,建立酒精性损伤细胞模型。用100mM、200mM酒精处理L02细胞24小时后,提取细胞蛋白,Western blot检测在酒精干预下肝细胞Cav-1表达的时间及浓度效应;使用ERK1/2抑制剂PD98059以及STAT3抑制剂SD-1029分别干预L02细胞,24小时后观察Cav-1的改变情况;用Cav-1小分子干扰RNA（siRNA）转染L02细胞诱导Cav-1的沉默,观察Cav-1相关蛋白的改变情况。3.人体临床试验本临床试验采用随机、平行、对照试验设计,共有65名年龄为21-35岁健康无长期饮酒史的健康男性受试者。为达到狂饮（Binge drinking）模型的要求,饮酒组需要在2h内饮用5个标准杯的白酒（一个标准杯相当于14g酒精）,对照组2h内饮用同等体积的水溶液。本临床试验通过了南方医科大学中西医结合伦理委员会的批准,批准编号[2013]伦理字（001）号,并在中国临床试验注册中心Chinese Clinical Trial Registry注册并审査通过,审批号:ChiCTR-TRC-13003344。本实验方案完全遵守1975年修订的赫尔辛基宣言中要求的伦理指导要求,所有受试者均签署知情同意书并自愿参加试验。在严格控制平行性饮食饮水的前提下,受试者在其饮酒前（Oh）及饮酒后各时间点（2h、6h、12h和24h）分别被采集血液样品并记录其生命体征以及呼气酒精浓度。采集的血液样品用来检测血液中酒精浓度、肝功能指标以及Cav-1、NO和相关炎症因子的表达水平。统计方法采用SPSS 20.0以及Graph prism 5.0软件统计分析并作图,实验结果通过均值±标准差表示。根据实验的设计不同采用不同的统计方法:各组间均数比较采用one-way ANOVA,方差齐性时采用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时采用Welch法,组间多重比较采用Dunnett’s T3法;重复测量数据采用repeated measures分析统计,满足球形检验时釆用Sphericity Assumed,不满足球形检验时采用Greenhouse-Geisser校正系数;两独立样本之间检验采用unpaired student’st-test;相关性分析采用 Spearman’s rank correlation test。P<0.05 为有统计学差异。结果一、急性酒精性肝损伤1.狂饮诱导正常小鼠血清和肝脏中的Cav-1改变1.1.单次狂饮诱导小鼠血清和肝脏Cav-1表达增加首先,我们在野生型小鼠不同的狂饮后时间点（Oh、6h、12h和24h）检测其血清和肝脏中Cav-1的表达情况。结果显示狂饮后小鼠血清和肝脏Cav-1的表达随时间改变而改变,血清和肝脏12h Cav-1水平同饮酒前Cav-1水平比较均有显著性差异（血清p=0.004;肝脏p=0.008）,血清中Cav-1同时显著高于饮酒后24h Cav-1水平（p=0.023）,表明狂饮后血清和肝脏中的Cav-1表达呈上升趋势,至12h时间点达到最高峰,然后下降的动态改变过程。1.2.狂饮模型中的小鼠血清和肝脏中Cav-1呈显著正相关性Spearman rank相关性分析方法进行统计结果显示:血清中的Cav-1同肝脏表达的Cav-1存在显著的正性相关性,相关因子:rs=0.808,p=0.000。1.3.狂饮后Cav-1表达改变主要发生在肝实质细胞和血管内皮细胞免疫荧光结果显示:狂饮后小鼠肝脏中Cav-1的表达有显著性上调,并主要发生在肝实质细胞以及血管内皮细胞。2.Cav-1基因的缺失增加肝脏对酒精性损伤的易感性2.1.三种基因型小鼠系的建立及基因鉴定我们采用Cav-1基因敲除小鼠与正常C57小鼠（Cav-1+/+）配对,繁育出C57背景的Cav-1基因敲除小鼠（KO,Cav-1-/A）以及Cav-1杂合子小鼠(Cav-1^+/-),应用于后续实验中。2.2.三种基因型同窝小鼠体征比较8-12周龄的同窝小鼠(Cav-1+/+、Cav-1^+/-以及Cav-1^-/-)体重观察无显著性差异（F=0.287,p=0.753）,采用这一周龄进行后续研究。2.3.狂饮显著上调正常小鼠肝脏Cav-1 mRNA水平,但对Cav-1杂合子小鼠Cav-1 mRNA水平无显著性影响正常野生型小鼠狂饮后,肝脏Cav-1 mRNA水平相比于对照组Cav-1 mRNA水平显著上调（p=0.0104）,而Cav-1^+/-小鼠狂饮后,肝脏中的Cav-1 mRNA 水平与对照组相比无差异（p=0.9807）。这可能与Cav-1^+/-小鼠自身的Cav-1基因不足导致部分功能缺失有关。2.4.Cav-1^-/-小鼠在相同狂饮条件下表现更高的血清转氨酶水平对Cav-1^-/-小鼠的肝功能进行评估,结果显示在相同的狂饮条件下,同野生型小鼠比较,Cav-1^-/-小鼠ALT和AST水平显著升高（p=0.039）,表明Cav-1基因的缺失可能增加了肝脏对酒精性损伤的易感性。2.5.Cav-1^-/-小鼠在相同狂饮条件下肝脏细胞凋亡加重我们又对Cav-1^-/-小鼠肝脏细胞凋亡情况进行了检测。结果显示,随着Cav-1基因的梯度缺失,Bcl-2的表达呈现下调改变（p=0.041）,而肝脏中Cleaved caspase3的表达上调（p=0.035）。TUNEL实验结果,狂饮后Cav-1^-/-小鼠同野生型小鼠相比凋亡细胞增加,证实Cav-1基因的缺失导致狂饮后肝脏细胞凋亡加重。2.6.Cav-1^-/-小鼠肝脏酒精代谢酶（ADH1和ALDH2）、过氧化氢酶Catalase以及超氧化合物歧化酶SOD1&2的表达无显著性变化我们调查了 Cav-1基因缺失对小鼠肝脏酒精代谢酶的影响,发现均无显著性差异（ADH1:p=0.8089;ALDH2:p=0.4002;Catalase:p=0.8894;SOD 1:p=0.699;SOD2:p=0.481）。表明肝脏酒精代谢酶 ADH1&ALDH2、Catalase 以及SOD1&2的表达不是Cav-1缺失诱导的小鼠狂饮后的肝脏损伤加重的主要因素。2.7.Cav-1^-/-小鼠肝脏总SOD、Catalase和ADH活性以及血清GSH的含量无显著性变化进一步,我们研究了 Cav-1基因缺失对小鼠肝脏抗氧化代谢酶的影响。与野生型小鼠相比,Cav-1^-/-小鼠的抗氧化代谢相关活性酶活性总SOD（p=0.3211）、Catalase（p=0.2667）和 ADH（p=0.2647）及血清 GSH 含量（p=0.7892）无显著性改变,表明抗氧化代谢相关酶SOD、Catalase、ADH的活性以及GSH不是Cav-1缺失诱导的小鼠狂饮后的肝脏损伤加重的主要因素。2.8.Cav-1^-/-小鼠相同狂饮条件下血清中NO水平显著性升高在相同狂饮条件下,Cav-1^-/-小鼠的血清中NO产生水平高于野生型小鼠,p=0.042,表明NO的产生可能参与到Cav-1缺失后肝脏的改变中。2.9.Cav-1^-/-小鼠相同狂饮条件下肝脏3-NT的表达显著性上调我们以ONOO-的生物标志物3-NT为指标,通过免疫组化方法检测了肝脏中ONOO-的产生情况。结果表明,同野生型小鼠相比,Cav-1^-/-除小鼠狂饮模型的肝脏中3-NT呈现显著上调。2.10.Cav-1^-/-小鼠相同狂饮条件下肝脏ONOO-的表达显著性上调同时我们采用了特异性的ONOO-荧光探针证实狂饮后Cav-1^-/-小鼠肝脏ONOO-的表达量与野生型相比有显著性升高。2.11.Cav-1^-/-小鼠相同狂饮条件下肝脏iNOS的表达显著性上调在Cav-1^-/-小鼠狂饮状况下肝脏iNOS的表达相比于Cav-1^-/-小鼠对照组明显增加（p=0.002）,并高于野生型小鼠狂饮状态下肝脏iNOS表达水平（p=0.005）;免疫组化结果亦表明,同野生型小鼠相比,Cav-1^-/-小鼠狂饮模型的肝脏中iNOS表达呈显著性上调。上述结果共同表明,在相同狂饮条件下中,iNOS的表达上调参与到Cav-1缺失诱导的NO产生增多过程。3.iNOS特异性抑制剂1400W显著性改善正常小鼠及Cav-1基因全敲小鼠狂饮模型的酒精性肝损伤3.1.1400W不影响肝脏中Cav-1的表达我们调査了 1400W对于肝脏中Cav-1蛋白的表达是否有影响。将野生型小鼠分为两组,1400W干预组小鼠与对照组小鼠肝脏中的Cav-1表达无显著性差异。由此推断1400W对iNOS的选择性抑制作用,不涉及对Cav-1的调节作用。3.2.1400W抑制狂饮后肝脏iNOS的活性和表达的上调经1400W预处理后狂饮导致的肝脏内iNOS表达量的升高被抑制（p=0.000）,且与对照组无显著性差异（p=0.314）,充分证明了 1400W的iNOS抑制作用。免疫荧光实验进一步证实,无论野生型小鼠或者Cav-1^-/-小鼠,1400W对狂饮导致的iNOS升高均有显著抑制作用。3.3.1400W预处理降低狂饮诱导的肝损伤加重经1400W预处理后,Cav-1^-/-小鼠在相同的狂饮条件下显著升高的ALT（p=0.036）和AST（p=0.040）水平均被显著性抑制,表明1400W的预处理能够降低狂饮诱导的肝损伤加重。3.4.1400W预处理减轻狂饮导致的肝细胞凋亡TUNEL实验证实,经1400W预处理后,Cav-1^-/-小鼠狂饮后肝细胞凋亡情况被显著性抑制,野生型小鼠的凋亡情况亦有减轻。3.5.1400W预处理降低狂饮后肝脏中3-NT表达的上调经1400W预处理,狂饮导致的Cav-1^-/-小鼠肝脏中3-NT表达上调被显著性抑制,野生型小鼠狂饮后3-NT表达亦未有上调,表明1400W可降低狂饮诱导的ONOO-的产生。充分证实了 iNOS在狂饮导致的Cav-1缺失小鼠肝损伤加重、肝细胞凋亡和ONOO-的诱导产生过程中的重要作用。4.Cav-1通过调控EGFR和STAT3信号转导参与到狂饮性肝损伤发生过程中4.1.Cav-1^-/-小鼠狂饮后肝脏STAT3和EGFR的活性显著上调,而ERK1/2的活性受到抑制我们测定了狂饮后肝脏中P-STAT3 Tyr705、P-EGFR和P-ERK1/2的表达。与野生型小鼠狂饮模型组比较,Cav-1^-/-小鼠狂饮模型的P-EGFR与P-STAT3均显著上调,而P-ERK1/2表达减少（p=0.050）,表明Cav-1在狂饮导致的肝损伤过程中可能抑制P-STAT3和P-EGFR的表达,同时促进P-ERK1/2的表达。4.2.酒精刺激导致L02细胞Cav-1表达和ERK1/2的活性呈剂量依赖性上调,STAT3的活性呈剂量依赖性下调为进一步研究Cav-1与ERK1/2及STAT3的相关性,我们采用人源肝细胞株L02细胞进行了体外实验。将L02细胞经100 mM或200 mM乙醇处理后12h,测定 P-STAT3/STAT3,P-ERK1/2/ERK1/2 及 Cav-1 表达,结果显示 200mM 酒精刺激L02细胞12h后Cav-1的表达与对照组相比呈上调改变（p=0.001）,同时伴有 P-ERK1/2 上调（p=0.002）以及 P-STAT3Tyr705 的下调（p=0.011）。4.3.STAT3特异性抑制剂诱导肝细胞P-STAT3表达下调而对Cav-1的表达无显著性影响应用STAT3特异性抑制剂SD-1092预处理L02细胞后发现,P-STAT3 Tyr705表达被显著抑制（p=0.035）,而Cav-1的表达无显著性改变（p=0.7681）,表明STAT3可能是Cav-1作用的下游。4.4.ERK1/2特异性抑制剂诱导肝细胞P-ERK1/2表达下调的同时下调Cav-1的表达应用ERK1/2特异性抑制剂PD98059预处理L02细胞后发现,在P-ERK1/2受抑制的同时,Cav-1的表达亦呈现下调改变（p=0.011）,表明ERK1/2参与调控Cav-1的表达过程。4.5.Cav-1 siRNA处理后肝细胞STAT3活性上调,ERK1/2活性无显著性改变我们应用Cav-1 siRNA处理L02细胞,结果表明当Cav-1表达显著降低时（p=0.000）,STAT3 的活性增加（p=0.017）;而 ERK1/2 活性在 Cav-1 siRNA 处理后无显著性改变（p=0.6728）。结合STAT3抑制剂和ERK1/2抑制剂实验结果,证实Cav-1对STAT3有负性调控作用,亦即Cav-1是STAT3的上游,而ERK1/2能够调控Cav-1表达的同时也会受到Cav-1缺失的影响,处于一种交互影响状态（Crosstalk）。5.临床狂饮模型肝损伤与Cav-1表达及NO释放相关性研究5.1.受试者实验完成情况经筛选后选定40位受试者进入狂饮组,25位参与者进入对照组。两组志愿者分别饮酒（或安慰剂）后,于规定时间点（Oh、2h、6h、12h、24h）采集血样,观察并记录饮酒反应、血液及呼吸酒精含量（BAC）。最终狂饮组共有32名志愿者以及对照组25名志愿者完成整个实验过程。5.2.狂饮者肝损伤程度与时间相关性研究经重复测量方差分析饮酒后BAC在2h达到最高浓度,随后持续下降,至12h恢复至正常水平。饮酒后血清AST和ALT水平24h以内ALT&AST水平均在正常范围,证明本临床实验对人体是安全的。此外,对照组受试者血清Cav-1水平无显著性变化,故排除了饮食对于本实验的影响。5.3.狂饮者血清Cav-1的表达量与NO的释放量成时间依赖性改变更有价值的是,狂饮后血清中Cav-1的表达和NO的释放量呈时间改变而改变（p=0.000）,至12h达到极大值,而后开始下降。这一趋势与ALT&AST变化一致。5.4.狂饮后血清Cav-1 水平与BAC及ALT&AST水平的相关性分析Spearman rank检验证实,狂饮后2h,Cav-1水平与BAC具有负相关性（rs=-0.436,p=0.0125）。狂饮后24h,血清Cav-1水平与ALT水平具有负相关性（rs=-0.4153,p=0.018）,表明饮酒后Cav-1水平与肝损伤的程度具有负相关性。5.5.狂饮后血清NO释放量与ALT&AST水平的相关性分析Spearman rank检验狂饮后24h血清中NO的释放量与AST水平呈正相关（rs=0.4762,p=0.0059）,表明饮酒后NO释放量与肝损伤的程度具有正相关性。综上,临床试验得出与体内、体外实验相一致的结论,Cav-1在狂饮导致的肝损伤中起到重要作用,且这一过程与NO的释放相关。二、慢性酒精性肝损伤1.小鼠慢性酒精性肝损伤模型建立将6-8周的野生型及Cav-1^-/-雄性小鼠喂养Lieber-deCarli液体饲料,并随机分为四组:野生型小鼠酒精液态词料喂养组和对照组;Cav-1^-/-小鼠酒精液态饲料喂养组和对照组。2.Cav-1基因缺失加重小鼠慢性酒精性肝损伤2.1.Cav-1^-/-小鼠长期饮酒后体重显著减轻四组小鼠造模完成后,野生型小鼠的酒精组和对照组体重基本无差别（p=0.934）,而Cav-1-/小鼠酒精组与对照组的体重有显著差异（p=0.012）,表明Cav-1的缺失可能诱导小鼠长期饮酒后健康状况恶化。2.2.Cav-1的缺失诱导长期饮酒后肝脏脂肪性变程度加重HE染色和油红O染色评估肝脏的脂肪性变程度发现,相比于野生型小鼠,酒精组Cav-1^-/-小鼠肝脏脂肪性变程度显著加重,表明Cav-1基因的缺失可能增加了肝脏对长期酒精性损伤的易感性。2.3.Cav-1的缺失诱导长期饮酒后血清转氨酶水平上调长期饮酒后,野生型和Cav-1^-/-小鼠ALT&AST水平均有显著性改变（p=0.000）。同野生型小鼠比较,Cav-1^-/-小鼠长期饮酒后AST水平显著性升高（p=0.032）,表明Cav-1基因的缺失可能加重了长期饮酒造成的肝损伤。2.4.Cav-1的缺失诱导长期饮酒后血清FFA水平上调为进一步评估Cav-1缺失对长期饮酒后小鼠肝脏脂质代谢的影响,我们测试了血清FFA水平,结果显示Cav-1^-/-小鼠模型组的FFA水平显著高于对照组（0=0.020）,并显著高于野生型小鼠酒精组（0=0.033）,表明Cav-1基因的缺失是诱导小鼠长期饮酒后血清FFA升高的重要因素。2.5.Cav-1的缺失诱导长期饮酒后血清TC水平上调TC水平测试结果亦有相同趋势,Cav-1^-/-小鼠模型组TC水平显著高于对照组（p=0.004）,并显著高于野生型小鼠模型组（p=0.027）,表明Cav-1基因的缺失是诱导小鼠长期饮酒后血清TC升高的重要因素。3.Cav-1在慢性酒精性肝损伤中作用机制研究3.1.长期饮酒后Cav-1以及过氧化物酶体增生物激活受体Y（PPAR-γ）表达损伤性降低检测慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏Cav-1的mRNA和蛋白表达水平以及血清Cav-1水平,显示长期饮酒导致肝脏中Cav-1 mRNA和蛋白表达水平及血清Cav-1的表达水平均显著降低（p<0.05）,与急性酒精性损伤过程中,Cav-1应激性升高的情况相反,表明长期饮酒有可能导致肝脏中Cav-1的表达损伤性降低。PPAR-y作为脂代谢的一个重要调节因子,在脂肪肝的形成过程中起到重要作用。我们研究了 Cav-1和PPAR-y表达的相关性,并证实长期饮酒导致肝脏中Cav-1的表达显著降低的同时,伴随有PPAR-y表达的显著下降。这个结果表明,PPAR-γ的降低,可能参与到了 Cav-1对慢性酒精性肝损伤的作用过程当中,具体机制还需进一步的研究证实。三、中药靶标治疗研究1.中药初筛及治疗慢性酒精性肝损伤作用研究我们尝试针对酒精性肝损伤进行药物干预,以Cav-1为靶点,在大量中药成分中筛选出一种对抗慢性酒精性肝损伤的中药单体-柚皮苷（Naringin,C27H32O14）。2.慢性酒精性肝损伤模型建立和柚皮苷处理小鼠慢性酒精性肝损伤模型建立过程的第3周后开始给予200mg/kg/d的柚皮苷溶于液态饲料中喂养,持续4周。3.柚皮苷缓解了长期酒精诱导的肝脏中Cav-1和PPAR-γ表达的下调长期饮酒过程中,同时柚皮苷处理,小鼠肝脏中Cav-1和PPAR-γ表达的下调均得到缓解并恢复正常水平,表明柚皮苷可能通过上调肝脏中Cav-1和PPAR-y的表达实现其肝保护作用。4.柚皮苷有助减轻长期饮酒导致的高脂血症为进一步验证柚皮苷的保护作用,我们检测了柚皮苷处理后的小鼠血清FFA、TC水平,结果发现柚皮苷处理后,Cav-1^-/-小鼠与野生型小鼠FFA与TC水平均有显著性下调（p<0.05）,这一结果证实了柚皮苷对抗长期饮酒导致的高脂血症作用,并为Cav-1作为慢性酒精性肝损伤治疗靶点的可行性提供了可靠的实验依据。结论基因敲除小鼠动实验、体外实验及人体临床实验充分阐明了 Cav-1通过调控EGFR/STAT3/iNOS信号通路,作为RNS应答主要调控者在急性酒精性肝损伤过程中起到重要保护作用;同时在慢性酒精性肝损伤中,Cav-1通过调控PPAR-r的表达参与到调控脂代谢过程,具有保肝及抗脂肪性变作用;以Cav-1作为生物靶点,通过慢性酒精性肝损伤的动物模型,筛选出了针对调控Cav-1的中药单体-柚皮苷,证实了其显著的保肝及降血脂作用,丰富了中药靶标治疗的理念,并为Cav-1这一靶点临床运用提供了实验基础。