农药的大量使用给人类的生存环境带来了巨大的污染问题。生物治理技术以其突出的优点成为治理环境污染的首选，而筛选得到能够分解含磷、硫或氮化合物等农药的微生物和酶系是生物治理技术中面临的重要课题之一。近年来在极端环境中发现的极端环境微生物(主要是古细菌)因其独特的新陈代谢途径，可以在极端环境下(高温、高压、高离子强度、极端pH等)下稳定生存，因而成为环保应用中的重要酶源，其中，嗜热酶以其突出的特点已经受到广泛的关注。 超嗜热菌是最适生长温度为80-110℃的一类极端微生物，从天然及人工高热环境中都能够分离得到超嗜热菌。从超嗜热菌中分离得到的超嗜热酶，具有很高的热稳定性。近年来科学工作者陆续发现了许多超嗜热菌，已经获得其中很多菌株的全基因组序列，但由于嗜热微生物的基因序列同我们已知的微生物同源性存在着显著差异，接近半数的功能基因的序列还未确认。充分利用超嗜热古细菌的基因资源、发现和鉴定其未知基因的功能，对确定超嗜热酶的分子机制、酶学特性和对生命起源与生命进化的探索都有重要的理论意义。在此基础上，开发超嗜热微生物中对农药有降解作用的超嗜热酶，通过有效的进化手段进行高效表达，在生物治污领域也具有广泛的应用价值。 本文以嗜热菌PyrococcushorikoshiiOT3为出发菌株，首先建立了该菌株的完整基因文库。提取PyrococcushorikoshiiOT3总DNA，利用限制性内切酶Sau3AI进行不完全酶切，琼脂糖凝胶回收长度为2-6kb大小的片断连接入质粒载体pET15b中，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)CodonPlus，随机挑选单克隆7144个保存于-80℃76个96孔板中。经检测，文库覆盖率达到99.99％。我们也尝试将质量合乎要求的DNA文库混合后，分装成小份于-80℃冻存；筛选时取小份培养于平板上，利用硝酸纤维素膜影印、裂解筛选。 筛选的针对范围为PyrococcushorikoshiiOT3全基因组中未能确认的基因序列；筛选的目的酶是具有农药成分的降解功能的新酶，如水解酶类和氧化酶类，首选的目的酶为酯酶；筛选依据为同为超高温嗜热菌的AeroperumpernixK1基因组中已经确认了含有酯酶基因，并经纯化表达证实具有良好的活性。 我们以超高温嗜热菌的AeroperumpernixK1的酯酶基因为阳性对照，以选取的E.coli表达系统，利用生色底物筛选技术针对目的酶确立高通量的活性筛选方法。 对于保存于96孔板中的基因文库，我们将文库的单克隆复制于96孔板中，经过初培养、诱导表达、菌体的收集和反复冻融破碎、热失活等一系列措施得到每个单克隆的细胞内含物悬液，以对硝基苯酚辛酸酯为底物建立筛选的反应体系，反应温度设为75℃。通过酶标仪快速扫描OD405的吸光度值，以阳性对照或者阴性对照进行筛选。以阳性对照为筛选物的试验表明，我们确实获得了准确度高、速度较快、重复性强的针对酯酶的筛选方法。 对于克隆混合保存的文库，我们尝试了利用硝酸纤维素膜进行影印、原位裂解、热失活等措施得到吸附有单克隆表达蛋白的硝酸纤维素膜，以NaphtholASNonanoate(α-萘酚壬酸酯)为底物，FastBlueBBSalt为显色剂，80℃短暂保温后进行色斑的筛选。以阳性对照为筛选物的试验表明，我们获得的针对酯酶的筛选方法简洁快速、污染少、对设备要求不高，筛选周期很短的优点，但也具有缺乏数据支持、可控性稍差等需要改进的不足。两种筛选方法可以混合使用，更能扬长避短、增加效率。