目的：　　Neuropilin2(NRP2)是一种多功能的新型受体，在神经系统发育、心血管系统、免疫系统及淋巴管生成等过程中发挥重要作用。最新研究表明，NRP2受体广泛表达于肿瘤细胞表面，与肿瘤血管形成以及肿瘤的发生发展、凋亡、粘附、侵袭和转移等生物学行为密切相关。多种肿瘤细胞均高表达NRP2，提示NRP2可能成为一种新型肿瘤标志物。NRP2通过多种机制调控肿瘤进展，NRP2-b1b2是其发挥作用的重要结构域，NRP2-b1b2结构域可以结合配体Ⅲ型Semaphorin和VEGF，并调控它们介导的相关信号通路。本文旨在通过杂交瘤技术制备抗NRP2-b1b2片段的单克隆抗体，通过鉴定该抗体的特性并探索该抗体在实际中的应用，为快速准确地分析不同恶性程度的肿瘤细胞或组织中NRP2的表达情况提供有利条件，同时也为进一步研究NRP2与肿瘤相关的信号通路奠定理论基础。　　方法：　　利用NRP2的b1b2片段(NRP2-b1b2)作为免疫原，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠，通过细胞融合技术构建可以稳定分泌抗NRP2-b1b2的单克隆抗体.的杂交瘤细胞株。然后体外扩大培养杂交瘤细胞，接种于Balb/c小鼠腹腔中，获得含有NRP2-b1b2单克隆抗体(NRP2 mAb)的腹水。通过rProtein A亲和柱纯化抗体;SDS-PAGE电泳分析抗体的纯度;间接ELISA鉴定抗体的活性。采用流式细胞术、Western blotting、细胞免疫荧光、免疫细胞化学染色实验以及免疫组织化学染色实验分别检测制备的单抗与结肠癌细胞株和移植瘤组织中NRP2蛋白的结合情况。免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织芯片中NRP2蛋白，分析NRP2蛋白在多种人肿瘤组织、配对癌旁组织以及不同分期的人结肠癌组织中的表达情况。利用自制的NRP2 mAb建立定量检测NRP2的夹心ELISA方法，建立标准曲线，分析方法的灵敏度和最低检测限，检测45例临床肿瘤血清和3例正常血清样本中NRP2的表达情况。MTT实验、集落形成抑制实验、凋亡实验、迁移实验检测NRP2抗体对结肠癌细胞生物学行为的作用。　　结果：　　我们成功获得了2株稳定分泌NRP2 mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为E4和C3。通过腹腔注射杂交瘤细胞得到的腹水经rProteinA亲和柱纯化得到了纯度较高的E4 mAb（纯度约为95％，浓度约为2 mg/ml）;间接ELISA结果表明E4 mAb的滴度在5×10-5左右，具有较高的亲和力。　　WB结果显示E4 mAb与NRP2-b1b2多肽及两株结肠癌细胞株LoVo、SW480总蛋白中的NRP2蛋白分别在34KDa、110KDa处有一结合条带，说明抗体与线性的NRP2可以很好的结合，并具有较高的特异性;流式细胞术、细胞免疫荧光和细胞化学染色实验结果表明，E4 mAb与结肠癌细胞自然存在的NRP2蛋白也可以很好地结合，并具有很高的特异性;免疫组织化学染色结果表明E4 mAb可以特异性地结合结肠癌细胞和移植瘤组织中的NRP2蛋白。组织芯片免疫组化结果显示，NRP2在多种肿瘤组织及配对癌旁组织中均有不同程度的表达;在不同分期结肠癌中，NRP2的表达情况存在着差异。　　应用自制的E4 mAb和C3 mAb通过夹心ELISA建立了定量检测NRP2的标准曲线，得到的回归方程为Y=0.0025x+0.2605，相关系数R2=0.9885，线性检测范围是12.5-400ng/ml。批内变异系数CV为5.72％，批间变异系数CV为7.33％，说明该检测方法的特异性、重复性、可靠性均较好。利用建立好的夹心ELISA方法检测45例临床肿瘤血清及3例正常血清样本，结果表明不同肿瘤血清中所含的NRP2量不同。　　MTT结果显示NRP2 mAb能抑制结肠癌细胞LoVo和SW480的增殖，且抑制作用与剂量正相关。集落形成抑制实验结果表明，不同浓度抗体均可显著抑制LoVo集落形成，并呈剂量依赖性。凋亡实验表明NRP2 mAb可诱导LoVo细胞凋亡。迁移实验表明不同浓度抗体均可抑制LoVo细胞迁移，并呈剂量依赖性。　　结论：　　1.本研究通过杂交瘤技术成功获得了2株稳定分泌NRP2 mAb的杂交瘤细胞株E4和C3，制备了大量纯度高、亲和力强的E4 mAb和C3 mAb。　　2.经流式细胞术、WB、免疫荧光、细胞化学染色以及组织化学染色鉴定，E4 mAb能与人结肠癌细胞以及人结肠癌组织中NRP2蛋白特异性结合。　　3.用E4 mAb验证了NRP2蛋白在多种人肿瘤组织芯片的表达情况，发现NRP2在一些肿瘤中表达上调，提示可能参与肿瘤的发生发展。　　4.应用E4 mAb和C3 mAb建立了定量检测NRP2抗原的夹心ELISA方法。　　5.E4 mAb可抑制结肠癌LoVo细胞增殖、迁移，促进凋亡并呈一定的浓度依赖性。