论文部分内容阅读
类黄酮化合物作为烟草中重要的致香前体物，可以影响烟叶的香味、吃味以及颜色等品质。本研究借助基因共表达分析筛选潜在的类黄酮合成相关转录因子，同源克隆候选转录因子基因，利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）、过表达(Over expression，OE)和高效液相色谱-串联质谱(High performance liquid chromatography-tandem massspectrometry，HPLC-MS/MS)等技术手段，从反向遗传学角度研究新挖掘的转录因子在调控类黄酮生物合成过程中的功能。主要研究结果如下: (1)基于烟草全基因组表达谱数据，分析发现打顶可以改变烟叶中类黄酮生物合成的流向，而且打顶还会影响烟叶中的激素信号和蔗糖信号。烟苗喷施脱落酸(Abscisicacid，ABA)和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)激素溶液，烟叶中可溶性糖含量显著降低、芸香苷含量显著升高;喷施赤霉素(Gibberellic acid，GA)激素溶液，烟叶中可溶性糖含量显著增加、芸香苷含量显著下降。说明MeJA、ABA和GA等植物激素和蔗糖信号在芸香苷合成过程中具有一定的调控作用。 (2)通过植物激素信号通路相关基因、蔗糖代谢相关基因、类黄酮合成相关基因及转录因子基因进行共表达分析，结合文献调研筛选确定NtMYB27、NtMYB48、NtMYB12a、NtMYB12b和NtPDF2等5个基因作为类黄酮合成相关候选转录因子基因进行研究。 (3) NtMYB27 CDS全长为597 bp，编码198个氨基酸;NtMYB48 CDS全长为666bp，编码221个氨基酸;NtMYB12a CDS全长为1254 bp，编码417个氨基酸;NtMYB12bCDS全长为1248 bp，编码415个氨基酸;NtPDF2 CDS全长为2199 bp，编码732个氨基酸残基。上述基因表达均具有明显的时空特异性，且易受到多种胁迫和激素处理的调控，预示着这些基因在烟草响应各种非生物胁迫和激素信号途径中具有重要作用。 (4) RNAiT1代转基因烟株中NtMYB27和NtPDF2基因表达量降低，烟叶黄酮醇和芸香苷的含量升高;而当RNAi T1代转基因烟株中NtMYB12a和NtMYB12b降低，烟叶黄酮醇和芸香苷的含量降低。说明NtMYB27和NtPDF2与烟草黄酮醇和芸香苷合成存在负调控关系，而NtMYB12a和NtMYB12b与烟草黄酮醇和芸香苷合成存在正调控关系。 (5)烟草NtMYB12a基因过量表达促进了类黄酮途径中NtPAL、Nt4CL、NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtFLS等基因的表达。NtMYB12aT1代转基因材料NtMYB12a基因表达量变化时，NtPAL、Nt4CL、NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtFLS等基因的表达也会随之发生变化，而NtDFR、NtANS和NtUGT等基因表达量没有明显变化，预示着NtMYB12a基因可能是通过调控类黄酮途径相关基因的表达进而影响烟叶中黄酮醇和芸香苷含量。 (6)蔗糖可以影响NtMYB12a基因的表达。GUS组织化学染色结果表明:蔗糖浓度升高可以增强NtMYB12a基因的表达，但这种效应存在两重性，当蔗糖浓度过高时反而抑制NtMYB12a基因的表达。