论文部分内容阅读
马铃薯Y病毒属成员是植物病毒中最大的被蚜虫以非持久方式传播的群体,马铃薯Y属病毒HC-Pro蛋白为病毒自身编码,在病毒生活史中体现出了多种不同功能。与很多已经鉴定出HC-Pro功能不同的是,在蚜虫传毒研究中必须使用具有生物活性HC-Pro蛋白的参与。因此本文我们采用毕赤酵母表达系统来获得具有生物活性的HC-Pro蛋白。采用基因工程技术构建酵母表达系统的重组表达质粒。将重组质粒转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)以此表达目的蛋白,并对表达蛋白进行鉴定。根据马铃薯Y病毒HC-Pro发表序列,设计1对引物。利用RT-PCR的方法,以感病植物叶片提取的RNA为模板,扩增此基因。所得的DNA片段经SnaBI和EcoRI双酶切后用T4DNA连接酶与pPIC9K载体进行连接,然后导入大肠杆菌DH5a,用PCR法筛选阳性转化子,并用双酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。重组质粒线性化后,用电击法将重组质粒转化入巴氏毕赤酵母,在缺组氨酸的MD板上筛选阳性菌落,然后用不同浓度的G418-YPD板筛选多拷贝插入单菌落。培养多拷贝插入的酵母细胞,用甲醇诱导目的蛋白的分泌,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白,免疫家兔制备抗血清。PCR扩增出两端带有SnaBI和EcoRI酶切位点的目的基因片段。目的基因经双酶切后连接载体pPIC9K,然后导入大肠杆菌DH5a中,在含氨卞青霉素(AMP)的卡那霉素(Kan )LB板上用PCR反应筛选出阳性菌落,双酶切结果表明目的基因已插入载体中,且方向正确,测序结果进一步证明马铃薯Y病毒HC-Pro基因表达质粒成功地克隆了目的基因片段。重组质粒转化巴氏毕赤酵母,G418筛选出多拷贝插入的单克隆,多拷贝插入的单克隆酵母细胞经摇瓶发酵和1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66KD处有一特异条带表达,目的条带蛋白占上清液总蛋白的40%。纯化后的HC-Pro蛋白免疫家兔,获得了效价为1:256的高价血清。Western blot鉴定表明,表达蛋白可以和兔抗HC多抗发生结合反应。