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目的:卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率高,治疗效果差。随着新辅助化疗的发展和医学模式的转变,化疗已成为卵巢癌治疗中不可或缺的治疗手段。在卵巢癌的化疗中,使用一些毒性小的抗肿瘤药物,充分发挥其治疗作用,减少对正常细胞的损伤,成为当前研究的一大热点。TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是新近发现的肿瘤坏死因子TNF家族成员,能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡且不影响正常细胞的生长分化,在肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值。大蒜素(Allicin)是大蒜中主要生物活性成分的总称。近年来,实验证实大蒜素能够通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤的发生。本研究以人卵巢癌SKOV-3细胞株为对象,探讨大蒜素与TRAIL单独及联合应用对卵巢癌细胞生长的影响及其作用机理,从而为临床上卵巢癌的化疗提供新的思路。方法:1细胞培养:常规复苏冻存的SKOV-3细胞接种于100ml培养瓶中,加入青、链霉素,使青霉素浓度为100IU/ml,链霉素浓度为100ug/ml,37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内松盖培育。以0.25%胰蛋白酶消化传代。2细胞增殖实验:取对数生长的SKOV-3细胞,制成浓度为6×104个/ml的细胞悬液,接种到96孔培养板,每孔100ul,置于37℃CO2培养箱中培养,24h后更换培养液,按以下几组分别加入含药培基:(1)含有不同浓度大蒜素(12.5、25、50、75mg/L)的培养基;(2)含有不同浓度TRAIL蛋白(25、50、100、200ng/ml)的培养基;(3)含有100ng/ml的TRAIL蛋白和50mg/L大蒜素的培养基;(4)空白对照孔(只加培养基)。每一浓度均设6个平行孔。继续培养24、48和72小时后,每孔加入10ul浓度为5mg/ml的MTT溶液,放回培养箱继续孵育4小时。吸净上清液,每孔加入二甲基亚砜100ul,振荡器上振荡8-10min,用酶标光度仪在波长为492nm时测定每孔的吸光度(OD)值。每个实验均重复3次。3流式细胞仪检测大蒜素对SKOV-3细胞TRAIL死亡受体DR4、DR5表达的影响:将浓度为4.5×104个/ml细胞接种于培养瓶。待细胞生长至对数生长期,换培养液,分为对照组(仅加培养基)、大蒜素组(加入含大蒜素50mg/L的培基),培养24h后,收集细胞,上样流式细胞仪进行死亡受体表达量分析,以检测样品荧光指数(FI)表示。实验重复三次取平均值计算大蒜素处理前后细胞死亡表达的FI值。4用Caspase活性检测试剂盒检测大蒜素对SKOV-3细胞株Caspase-3、8活性的影响:将浓度为4.5×104个/ml细胞接种于接种于培养瓶。待细胞生长至对数生长期,换培养液,分为对照组(仅加培养基)、大蒜素组(加入含大蒜素50mg/L的培基),培养48h后,收集细胞,按照说明书操作,用分光光度计测定OD405。通过OD试验组/OD空白组的比值检测大蒜素对卵巢癌SKOV-3细胞Caspase-3、8活化程度的影响。实验重复三次。5 RT-PCR法检测大蒜素对SKOV-3细胞TRAIL死亡受体DR4、DR5及Caspase-3、8表达的影响:取对数生长期细胞以4.5×104/ml的密度接种于培养瓶,置于孵箱中培养,待每瓶细胞生长至80-90%时,设对照组(仅加培养基)和加药组(含50mg/L大蒜素的含药培基),继续培养8小时后,收集细胞提取总RNA,cDNA的合成,PCR的扩增及琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像系统观察DR4、DR5及Caspase-3、8与β-actin基因扩增产物电泳条带的吸光度比值,表示DR4、DR5与Caspase-3、8的相对表达水平。实验重复三次,取平均值。统计学方法:细胞吸光度值(OD)和DR4、DR5、Caspase- 3、8表达用±s表达,两个样本均数的比较用t检验;三组及以上资料的多组间比较,采用方差分析。计数资料用χ2检验。所有数据均用SAS软件包进行统计。P<0.05为差异有显著性意义。结果:1 SKOV-3细胞的形态学观察:倒置显微镜观察:对照组细胞生长状态良好,细胞伸展,呈梭形。加药培养24h后细胞数目减少,细胞明显皱缩,体积变小,细胞间隙增大,有凋亡小体形成。2大蒜素和TRAIL对SKOV-3细胞生长影响:大蒜素和TRAIL单独以及联合应用处理人卵巢癌SKOV-3细胞24、48、72h后,随着药物浓度和作用时间的增加,抑制率增高,表现为时间和剂量依赖关系。各组细胞抑制率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3流式细胞仪检测:大蒜素作用24小时后SKOV-3细胞TRAIL死亡受体的表达明显上调,DR4、DR5的FI值分别由用药前的1.78、1.94升高到2.27、2.58,用药前后DR4、DR5表达差异有统计学意义(P<0.05)。4 Caspase-3、8活性检测:经大蒜素作用48小时后,SKOV-3细胞Caspase-3、8活性明显增加,Caspase-3、8活性的OD试验组/ OD空白组分别是用药前的2.49、2.08倍,用药前后Caspase-3、8活性差异有统计学意义(P<0.05)。5 RT-PCR检测:经大蒜素作用8小时后,DR4、DR5及Caspase- 3、8 mRNA基因扩增产物与β-actin基因扩增产物电泳带的吸光度比值明显升高,DR4、DR5为对照组的1.45、1.52倍,Caspase-3、8分别为对照组的2.03、1.55倍,差异有统计学意义(P<0.05 )。结论:(1)卵巢癌SKOV-3细胞是大蒜素和TRAIL敏感细胞株。(2)大蒜素可以增强TRAIL诱导细胞凋亡作用。(3)大蒜素上调卵巢癌SKOV-3细胞TRAIL死亡受体DR4、DR5的表达是其增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。(4)大蒜素上调Caspase-3、8 mRNA的表达、并激活Caspase-3、8蛋白酶是其增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的另一重要机制。上述结论为大蒜素和TRAIL应用于临床肿瘤的辅助治疗提供充分的实验室依据。