背景与目的：在局灶性脑缺血－再灌注过程中，神经元DNA损伤－修复机制的失衡可以造成神经元DNA的不可逆损伤，进而导致神经元调亡和死亡，这是急性缺血性脑血管病脑组织损伤的重要过程。脑缺血－再灌注的过程中，氧供及能量代谢受到破坏，会产生氧自由基等毒性物质，对缺血部位神经元造成损伤，进而导致细胞凋亡和坏死。在这些细胞毒性物质中，氧自由基的研究最为充分。氧自由基是局灶性脑缺血－再灌注过程中有氧代谢、花生四烯酸代谢以及脂质过氧化的主要毒性产物，它可以造成DNA碱基损伤, 进而导致DNA单链断裂和双链断裂。在DNA受到损伤的同时，细胞内DNA的修复机制也同时激活并力图修复已经造成的各种DNA损伤以维持细胞基因组的稳定性。如果脑缺血－再灌注造成的DNA损伤不能及时得到修复或者不能完全修复，最后就可能造成整个细胞的不可逆损伤。此外，在脑缺血－再灌注的过程中的重要现象--海马CA1区神经元选择性易损性（Selective vulnerability）和迟发性神经元死亡（Delayed neuronal death，DND）也被证明与DNA损伤及修复有关。越来越多的研究表明，细胞死亡机制中DNA的破坏与修复的失衡是卒中和脑损伤的重要基础。关于DNA修复相关蛋白的表达与脑缺血－再灌注损伤的关系，多数作者主要观察了DNA修复相关蛋白的表达变化与缺血－再灌注后神经细胞凋亡之间存在的时间和空间关系。多数DNA修复相关蛋白在出现明显的细胞凋亡之前，表达明显降低，或其活性降低；采用DNA修复相关蛋白与细胞凋亡标志物进行双标染色（Double-staining），显示DNA修复相关蛋白阳性的细胞，凋亡标志则为阴性，反之，修复蛋白阴性的细胞凋亡标志则为阳性。另一方面，亚致死量的脑缺血或低温脑保护措施则可以诱导DNA修复相关蛋白的表达或增加蛋白活性，或保护蛋白活性不致降低，进而减少神经元的凋亡。这就提示缺血－再灌注损伤在导致DNA损伤的同时，可能还阻碍了DNA修复相关蛋白的转录、表达和蛋白的活性，进而使缺血－再灌注后DNA损伤不能得到有效修复，最后导致细胞凋亡和死亡。增殖细胞核抗原（Proliferating-cell nuclear antigen，PCNA）是一种重要的DNA修复相关蛋白，参与了多种DNA修复过程。Tomasevic等发现，所有脑区的神经元均<WP=9>有PCNA mRNA和蛋白的组织源性表达，常温下脑缺血后CA1区神经元的核PCNA免疫活性在细胞死亡前大大下降，而在低温条件下脑缺血后Western blot显示PCNA蛋白总量没有明显变化。国内徐广润等采用光化学法诱导老龄大鼠局灶性脑缺血，缺血24小时在缺血中心区无PCNA表达，而在神经元受损较轻的缺血周边区则于缺血后4小时即有PCNA表达，24小时时明显增强。这提示在脑缺血－再灌注过程中，PCNA蛋白的变化可以影响ＤＮＡ损伤的修复过程，并可能影响缺血后受损神经元的转归。目前关于局灶性脑缺血－再灌注后DNA损伤及其修复的研究仍存在不少疑问。如上述Tomasevic 和徐广润等的研究仅仅检测了大鼠脑缺血后PCNA mRNA及蛋白表达的动态变化，而未将这一动态变化与DNA损伤的情况以及损伤局灶的病理变化联系起来。因此，我们设想，通过检测大鼠缺血－再灌注后DNA修复相关蛋白PCNA的表达情况和DNA损伤、细胞凋亡的动态变化，就有可能深入了解PCNA在局灶性脑缺血－再灌注过程中对DNA损伤修复机制中的作用，为从DNA损伤修复角度对局灶性脑缺血－再灌注损伤进行干预提供理论依据。实验方法：选择250g-300g健康Wistar大鼠48只，随机分为对照组（CO组）、伪手术组（FO组）和缺血－再灌注组（IR组，大脑中动脉缺血2小时，按照再灌注时间不同分为IR2h、IR4h、IR12h、IR24h、IR48h、IR96h组），共计8组，每组大鼠6只。用刘亢丁等改进Longa的线栓法制作大鼠缺血－再灌注模型。按照不同的再灌注时间处死实验动物，处死前用5分制评分法进行神经功能缺损评分。处死实验动物后立即灌注取脑，常规HE染色观察神经元病理变化。免疫组化法测定8-OH dG和PCNA，TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL法）检测DNA双链损伤。单细胞凝胶电泳检测DNA单链损伤。计量资料进行组间比较采用方差分析（ANOVA），组内比较采用LSD检验（方差齐性）或者Dunnett T3检验（方差不齐性），各手术组与伪手术组（FO）比较采用Dunnett t 检验。对神经功能缺损评分与神经元DNA损伤及PCNA表达的关系进行Logistic回归分析。P＜0.05为有显著统计学意义差异，P＜0.01为有非常显著统计学意义差异。结果：1. 缺血再灌注后24小时至48小时实验动物神经功能缺损最为明显，再灌注96小时后逐渐减轻。<WP=10>2. 再灌注后2h，皮层和海马CA1区DNA碱基损伤开始出现，至12－24小时时达到高峰，此后逐渐下降；至96小时明显下降接近正常水平，与伪手术组(FO)无显著差异。 3. DNA单链损伤最早出现在再灌注后2小时，但在随后的再灌注4小时和8小时明显增高，至12小时时达到高峰，此后逐渐下降。 4. DNA双链损伤于再灌注后2小时出现，至24－48小时达到高峰，此后逐渐下降，持续至再灌注96小时仍高于FO组；但海马CA1区DNA双链损伤明显加重出现于再灌注12小时，晚于皮层，损伤高峰持续时间也长于皮层（48小时