论文部分内容阅读
随着自由基医学的不断发展，人们对氧化应激在疾病发生、发展中作用的认识也不断深入。研究表明氧化应激与癌症、心脑血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等密切相关。寻找优异的抗氧化剂，特别是天然抗氧化剂应用于氧化应激相关疾病的预防与治疗已成为临床医学、预防医学、药学等领域的重要课题之一。本课题以蔷薇科多年生草本植物龙牙草(Agrimonia pilosa Ledeb.)的全草——仙鹤草为研究对象，利用天然药物化学、计算化学、药理学和现代仪器分析等多学科的理论及方法，重点围绕仙鹤草提取物及其各极性部位的抗氧化活性、活性部位的化学成分、单体的抗氧化活性及其清除自由基的构效关系和抗氧化活性物质特征指纹图谱进行了研究。论文研究获得如下主要结论：
①以清除DPPH·活性为评价指标，获得了仙鹤草抗氧化活性物质群的最佳提取工艺为：乙醇体积分数为54.68％、液料比为21.78、提取温度为74.6℃、提取时间2h，提取次数3次。
②采用DPPH·体系、核黄素光照体系、H2O2-Fe2+体系、β-胡萝卜素/亚油酸体系、紫外线-H2O2-pBR322 DNA体系和BSA-Glu体系，研究了仙鹤草粗提物及各极性部位的清除自由基、抗脂质过氧化、抑制DNA氧化损伤和蛋白质非酶糖基化的活性，结果表明：(1)仙鹤草粗提物具有显著的清除自由基的活性，对DPPH·、O2-·和·OH的半数清除浓度(EC50)分别为：6.45、8.94和103.16μg/mL；较强的抗脂质过氧化的活性，抑制β-胡萝卜素淬灭的半数抑制浓度(IC50)为10.13μg/mL；较强的抑制蛋白质非酶糖基化的活性，在1.0mg/mL时，其对蛋白质糖基化的抑制率达到了70.33％；一定的抑制DNA氧化损伤断裂的活性(图3.6)。(2)仙鹤草提取物抗氧化的主要活性部位为乙酸乙酯部位和正丁醇部位。二者的清除DPPH·、O2-·和·OH的EC50分别为4.88、7.29、63.96μg/mL和5.64、7.66、81.31μg/mL；二者抑制β-胡萝卜素淬灭的IC50分别为5.42、4.97μg/mL；乙酸乙酯部位表现了显著的抑制蛋白质非酶糖基化的作用，在1.0mg/mL时，其对蛋白质糖基化的抑制率达到了84.41％；对DNA氧化损伤的保护作用也以乙酸乙酯部位最强。(3)酚类化合物是仙鹤草中的主要抗氧化活性物质群。清除2-·和·OH的活性、抗脂质过氧化活性及抑制蛋白质非酶糖基化活性均与总酚含量显著相关(p＜0.05)。
③以分离技术和现代波谱技术等研究手段，从乙酸乙酯部位分离鉴定了23个化合物，包括14个黄酮类化合物：槲皮素、儿茶素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、木犀草素、木樨草素-7-O-葡萄糖苷、花旗松素、山奈酚、异牡荆苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、银椴苷、芹菜素和牡荆苷；2个异香豆素化合物：仙鹤草内酯和仙鹤草内酯-6-O-葡萄糖苷；7个三萜类化合物：β-胡萝卜苷、熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸、马斯里酸、萎陵菜酸和1β，2β，3β，19α-四羟基-12-烯-28-酸。其中花旗松素、牡荆苷、异牡荆苷、熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸和马斯里酸为首次从仙鹤草中分离得到。
④清除DPPH·的活性研究表明黄酮类化合物为仙鹤草抗氧化活性的主要活性成分。14种黄酮类化合物清除DPPH·活性的强弱顺序为：槲皮素＞儿茶素＞金丝桃苷＞芦丁＞槲皮苷＞木犀草素＞木樨草素-7-O-葡萄糖苷＞花旗松素＞山奈酚＞异牡荆苷＞山奈酚-3-O-葡萄糖苷、银椴苷、芹菜素、牡荆苷。其中槲皮素、儿茶素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、木犀草素、木樨草素-7-O-葡萄糖苷对DPPH·的半数清除浓度小于10μM，活性优于抗坏血酸和2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)，差异显著(p＜0.05)。首次发现异牡荆苷清除自由基活性显著优于其苷元芹菜素，即芹菜素C-6成苷可显著提高清除自由基活性，这可能是提高黄酮类化合物抗氧化活性的又一可选择的结构修饰途径。
⑤采用AM1半经验和密度泛函计算相结合以及多层Oniom计算的量子化学方法，研究了14个黄酮类化合物的O-H解离焓(BDE)和自由基自旋密度，对黄酮类化合物清除自由基活性与结构的关系进行了量子化学理论探讨。结果表明：(1)3-OH、B环上的邻羟基、2,3-双键和4-羰基的存在可以使自由基的自旋密度分布更加均衡，降低B环的O-H的BDE，提高化合物清除自由基的活性；(2)黄酮醇3-OH的糖苷化可增大B环和C环的夹角，导致自旋密度不均衡性的增加，升高B环的O-H的BDE，降低化合物清除自由基的活性；(3)黄酮A环C-6成苷可导致其自由基的自旋密度分布更加均匀，提高自由基的稳定性；而C-8成苷可使B环和C环的夹角增大，导致离域度的降低，降低自由基的稳定性。理论计算取得了与活性实验研究相一致的结论。
⑥建立了仙鹤草原种11个样品和变种4个样品的黄酮类化合物特征HPLC指纹图谱，对15个样品聚类分析的结果与药材实际来源情况相符，表明黄酮类化合物特征指纹图谱可用于仙鹤草原种与黄龙尾变种的鉴别。同时建立了仙鹤草原种和黄龙尾变种的黄酮类化合物特征指纹图谱共有模式，确定了部分主要色谱峰的归属(图6.10，6.11)。