家蚕是鳞翅目模式生物,其精子具有二型性,即有核精子和无核精子。在受精过程中,有核精子使卵受精并发育成子代个体,而无核精子不能与卵结合,先于有核精子进入雌蛾体内,在有核精子受精过程中起辅助作用。目前无核精子发生及成熟的具体分子机制尚不清楚。本论文以家蚕为研究对象,形态学观察精子的发生和成熟过程,确定成熟有核精子束和无核精子束分化的具体时期;同时施加外源蜕皮激素和低温处理,研究激素和温度对无核精子发育及受精过程的影响;最后分离家蚕有核精子和无核精子,转录组测序研究二者差异表达的基因,揭示无核精子在受精过程中的调控机制。主要研究结果如下:1.成熟无核精子束出现于预蛹期第2天。为了确定成熟有核精子束和无核精子束分化的时间,我们摸索出一种快速鉴定家蚕精子的方法:解剖家蚕幼虫及蛹精巢,在TC-100完全培养基（添加10%胎牛血清）中剥离包膜,4%多聚甲醛固定30 s,DAPI染色10 s即可清晰地观察到精子束中的DNA,整个固定和染色过程只需不到3 min。用该法对家蚕4龄幼虫到处女蛾发育过程的精子形态进行观察,发现成熟有核精子束在5龄2天出现,成熟无核精子束在预蛹期第2天出现,蛹期无核精子束迅速增多,至蛹末期达75%,成虫期接近80%,随着雄性处女蛾龄期延长,精巢粘滞度增加。2.无核精子对产卵和后代发育的影响。为进一步验证成虫期高比例的无核精子对家蚕产卵和后代发育的影响,使用成虫第1天到第5天的雄处女蛾分别与雌处女蛾进行交配,统计雌性的繁殖能力和后代发育情况。结果显示:成虫第2天雄处女蛾与羽化第1天雌处女蛾交配后受精卵正常的个体比羽化第1天雄处女蛾与第1天雌处女蛾交配所产后代下降13%;至延迟交配第3天,雄处女蛾无核精子比例超过80%,交配后受精异常个体的比例达20%,幼虫较正常个体发育迟缓。表明高比例的无核精子会导致卵成功受精的比例下降,也可能是延迟交配造成有核精子活力下降导致受精率降低,具体机制还需进一步研究。3.蜕皮激素和温度对家蚕精子发育的影响。家蚕精子发育与化蛹过程密切相关,为了验证无核精子发育是否受控于蜕皮激素信号通路,解剖预蛹第1天的家蚕精巢,施加5μM、10μM、50μM的蜕皮激素类似物20E进行体外培养;同时用5μg和10μg的20E注射5龄2天的家蚕幼虫血淋巴,检测蜕皮激素对无核精子发育的影响。结果表明:体外施加20E处理24 h和48 h后,均无无核精子束出现;在幼虫体内注射蜕皮激素24 h、48 h、72 h后,家蚕虽然提前蜕皮,但无核精子束仍未出现。但有核精子束比例随着蜕皮激素注射剂量的增加而增加,呈现剂量依赖效应。表明蜕皮激素能使家蚕中的有核精子发育加速,而对无核精子成熟没有明显的影响;同时在养蚕业中发现,高温会使家蚕无核精子数量下降,导致成虫产卵率下降。为了探索温度是否影响了无核精子的发育,将预蛹第1天的雄蚕在5℃、15℃、25℃下处理24 h、48 h、72 h,取样统计无核精子出现的比例。结果表明:25℃处理48 h和72 h时均有无核精子出现,而低温5℃和15℃处理至72 h仍无无核精子出现,并且预蛹期延长。表明低温不能诱导无核精子产生。4.家蚕有核精子和无核精子差异表达基因的研究。为了揭示有核精子和无核精子的发育调控机制,我们首先探索了一种高效分离有核精子束和无核精子束的方法,即采用70μm和100μm单层细胞筛和双层细胞筛对两类精子进行筛分效果比较,结果表明70μm的双层细胞筛可以分离出95%的无核精子束,70μm单层细胞筛可以分78%的有核精子束,获得了较好的分离效果。随后对分离后的有核精子束和无核精子束分别进行转录组测序（RNA-seq）,结果表明:在有核精子中表达的基因有11888个,在无核精子中表达的基因有11802个,11111个基因在有核精子和无核精子中共表达。进一步分析发现在有核精子和无核精子中显著差异表达的基因共737个,其中差异最显著的为muscle LIM protein、cuticle protein、actin5C等基因,它们在有核精子中高表达,无核精子中表达较少或不表达。GO分析显示:膜相关蛋白在差异表达的基因中占比最高。KEGG分析显示:差异表达的基因多集中在代谢通路和信号通路相关基因上,其中甲状腺激素信号通路和肌醇三磷酸信号通路基因在差异基因中占比较大,且部分基因在两种类型精子中差异表达显著。表明有核精子和无核精子在细胞增殖和凋亡过程中存在较大差异。5.差异基因表达谱验证。通过转录组数据分析,我们选择代谢通路差异显著的10个基因分别为nas-4（hatching enzyme-like protein precursor）、trypsin-like isoform X1、Mlp84B、cuticular protein hypothetical 19 precursor、Act5C、cuticular protein hypothetical 18 precursor、BGI-nonel-T002202、C2H2-type zinc finger protein、polynucleotide 5’-hydroxyl-kinase、Cpsf73（cleavage and polyadenylation specificity factor 73）,Q-PCR验证其表达谱。结果显示:Act5C、BGI-novel-T002202、trypsin-like isoform X1、hatching enzyme-like protein precursor、cuticular protein hypothetical 19 precursor、Mlp84B、cuticular protein hypothetical 18 precursor在有核精子中高表达,表明细胞骨架、代谢、蜕皮及肌肉发育相关基因在有核精子区别于无核精子的形态维持上发挥关键作用。polynucleotide 5’-hydroxyl-kinase、Cpsf73、nas-4在无核精子中高表达,表明无核精子中基因的3’-末端多聚腺苷酸化过程可能区别于有核精子,推测在调控无核精子发生的过程中起关键作用。综上所述,本论文首先发明了一种快速鉴定有核和无核精子的方法,利用该方法对家蚕成熟无核精子束出现的具体时间进行确定;其次研究激素蜕皮激素和成虫延迟交配对受精及后代的影响;最后成功分离有核精子束和无核精子束,转录组测序分析获得两类精子中差异表达的基因共737个,进一步对差异表达基因进行表达谱的分析,该结果为进一步研究家蚕精子的发育及无核精子在受精过程中的作用机制提供了前期基础。