论文部分内容阅读
背景：母婴间的微囊泡（Mcrovesicles，MV）通讯机制，越来越受到人们的关注。脐血是母婴间通讯的纽带，在妊娠过程中，脐血微囊泡可以调节母体免疫系统、促进胚胎发育和器官发育等。miRNA是一类转录后调节基因表达的非编码RNA，是微囊泡通讯机制中重要的信息分子。微囊泡将miRNA传递给受体细胞，改变受体细胞的功能，从而发挥细胞间“信使”的作用。研究表明，miRNA具有调节乳腺上皮细胞，促进泌乳的作用。let-7g和miR-221可调控乳腺上皮细胞的增殖及β-酪蛋白的分泌，miRNA-142-3p通过靶向调控泌乳素受体PRLR的表达，影响下游信号通路的变化，从而影响乳腺上皮细胞酪蛋白的合成与分泌。本文从健康足月产妇新生儿脐血中分离微囊泡，通过对其结构、与泌乳相关miRNA表达谱和生物信息学分析，以及微囊泡影响人乳腺上皮细胞HBL-100分泌酪蛋白的实验验证，证实存在促进泌乳的脐血微囊泡通讯机制。有望揭示脐血微囊泡调控泌乳的现象及其相关机制，为母婴间信息通讯提供新的思路。 目的：⑴明确脐血微囊泡结构及其miRNA特征。⑵验证促进泌乳的脐血微囊泡通讯方式。⑶促进人乳腺上皮细胞分泌乳蛋白脐血微囊泡通讯机制。 方法：①经重庆医科大学伦理委员会批准及患者本人知情同意，收集脐血标本70例。所有患者临床资料完整。胎盘娩出后，用脐血袋立即无菌采集新生儿脐血100 ml，6小时内提取囊泡。②用差速离心法提取脐血微囊泡，透射显微镜观察脐血微囊泡的形态，WB鉴定其表面分子CD63，激光粒度仪和纳米颗粒跟踪分析仪对脐血微囊泡进行尺度分析。RNA毛细血管电泳定性定量分析脐血微囊泡的总RNA。③通过文献挖掘、数据库搜索和同源序列分析获得人泌乳相关miRNA，用ClueGO软件对miRNA的靶基因进行GO分析和KEGG pathway分析，用Cytoscape软件构建miRNA-靶基因的网络图。用高通量PCR分析脐血微囊泡miRNA表达谱。④用FITC标记的微囊泡与人乳腺上皮细胞HBL-100共培养。共聚焦显微镜观察脐血微囊泡与人乳腺上皮细胞HBL-100相互作用的方式，ELISA法检测乳腺上皮细胞培养上清中酪蛋白的含量，RT-PCR和WB检测泌乳相关重要基因PRLR、STAT5、Akt和mTOR的mRNA和蛋白的表达。 结果：⑴采用12000g的离心力从健康足月产妇新生儿脐血中分离出平均直径167.0±77.1nm的圆形或类圆形小体，表达膜表面抗原分子CD63。RNA毛细血管电泳显示，在20nt处有峰值，表明脐血微囊泡内含有miRNA。⑵通过文献挖掘和数据库搜索，得到112条在小鼠、大鼠、牛、山羊、绵羊等动物泌乳期差异表达的miRNA，其中83条miRNA上调表达，29条miRNA下调表达。使用BLAST同源序列分析发现，上调的miRNA中有51条miRNA与人类miRNA高度同源（E-value<6.00 E-04）,有18条下调的miRNA与人类miRNA高度同源（E-value<6.00 E-04）；使用靶基因预测工具预测miRNA的靶基因，结果显示，上调表达的miRNA一共预测到1129个靶基因，下调表达的miRNA一共预测得到835个靶基因；通过对差异表达的miRNA的靶基因进行GO分析，发现其靶基因参与的细胞生物学功能包括大分子生物合成与代谢、细胞代谢、神经系统发育、RNA合成与代谢、基因表达和转录调控等；进一步对这些差异表达的miRNA的靶基因进行Pathway分析。发现其靶基因参与的信号通路广泛，其中包括 MAPK信号通路、肿瘤microRNA信号通路、mTOR信号通路、甲状腺信号通路、干细胞多能性信号通路、PI3K-Akt信号通路和TGF-β信号通路等；使用Cytoscape软件构建miRNA-靶基因网络图。结果显示， miRNA靶向调控主要由miRNA-30a， miRNA-23a， miRNA-27a， miRNA-15b， miRNA-16， miRNA-29，miRNA-22，miRNA-106a这8个miRNA参与了乳蛋白重要相关基因PRLR、STAT5、Akt和mTOR的调控。经miRNA高通量PCR分析，共表达337个miRNA，包含let-7g、miR-221、miRNA-142-3p、miR-101a、miR-122、miR-132和 miR-27a的表达。55个泌乳相关miRNA，占脐血微囊泡总的miRNA的25.22％。选取其中26个差异表达最显著的miRNA做qPCR验证。平均CT值稳定表达在20-30。⑶脐血微囊泡（30μl）与人乳腺上皮细胞HBL-100((1×105个/孔)共培养，随着时间的增加培养液上清中酪蛋白（CSN2）的水平呈升高趋势，在共培养96小时，CSN2的浓度达16ng/ml，与对照组比较，有显著差异（P<0.05）。将FITC标记的脐血微囊泡加入到人乳腺上皮细胞HBL-100培养基中，共培养4h后，观察到HBL-100细胞内呈现绿色FITC荧光。与脐血微囊泡共培养48h后，观察人乳腺上皮细胞HBL-100中PRLR、EGFR、STAT5、Akt、mTOR mRNA的表达，其中PRLR mRNA表达水平与对照组相比显著升高（P<0.05），其余基因的mRNA表达与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。Western blotting结果显示微囊泡共培养组，HBL-100表达PRLR、STAT5蛋白质水平显著高于对照组（P<0.05）。 结论：①采用12000g的离心力，发现人脐血中存在平均直径167.0±77.1nm的微囊泡，表达膜表面抗原CD63分子。含有大量miRNA。②脐血微囊泡包含泌乳相关miRNA，与人乳腺上皮细胞HBL-100的结合进入细胞内，促进细胞体外分泌乳蛋白、促进细胞的PRLR和STAT5mRNA水平和蛋白质表达水平，提示存在促进泌乳的微囊泡通讯方式，表明其调控 HBL-100分泌乳蛋白，可能通过miRNA-PRLR-STAT5信息通路。