促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone,GnRH）主要是由下丘脑GnRH神经元合成和分泌,通过垂体门脉系统到达垂体,作用于垂体促性腺激素分泌细胞,促进黄体生成素LH和促卵泡素FSH的合成和分泌,进而调节外周靶性腺类固醇激素的产生,形成调控生殖器官发育和配子生成的下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG）。星形胶质细胞（Astrocyte,AST）是脑内分布最广,数量最多的一类细胞。它们连续地分布于整个中枢神经系统,有着支撑、提供营养、免疫等多样的生物学功能。本课题组前期实验证明星形胶质细胞表达GnRH受体（Gonadotropin-releasing hormone receptor,GnRHR）,GnRH通过与GnRHR结合,作用于MAPK调节星形胶质细胞PGE2、TNF-α等细胞因子的表达。同时,另有研究表明,星形胶质细胞可以通过分泌GnIH（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）负向,kisspeptin正向调节下丘脑GnRH的合成和分泌。因此,本实验通过体外培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞,研究GnRH是否通过GnRHR-Ras-MAPK路径调节GnIH和kisspeptin的表达,找到GnRH通过星形胶质细胞反馈调控下丘脑GnRH神经元新的分子路径,阐明下丘脑GnRH合成和分泌的反馈调控新机制。其主要研究内容为:（1）体外条件下,GnRH对星形胶质细胞细胞活性的影响;（2）GnRH对星形胶质细胞GnIH、kisspeptin表达的影响;（3）GnRHR-Ras-MAPK通路在GnRH调节星形胶质细胞GnIH和kisspeptin表达中的作用。具体如下:（1）实验选取出生1³d的SD大鼠乳鼠,分离下丘脑,体外培养原代和传代星形胶质细胞。待细胞长到特定形态,表达特异性标记蛋白胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）时。经多次纯化达到纯度为95%以上,为后续试验提供基础。（2）为探索不同浓度的GnRH刺激是否能够影响星形胶质细胞细胞活性。实验选取浓度分别为10^-12 mol/L、10^-10 mol/L、10^-8 mol/L、10^-66 mol/L的GnRH来刺激体外培养的活性无差异的星形胶质细胞,作用时间为1h、4 h、8 h、12 h、24 h。后续用CCK-8法检测星形胶质细胞活性。结果显示,浓度为10^-10 mol/L的GnRH,作用8h后星形胶质细胞活性得到显著提高。（3）为探索不同浓度的GnRH刺激是否能够影响星形胶质细胞GnIH、kisspeptin的表达。实验选取浓度分别为10^-12 mol/L、10^-10 mol/L、10^-8 mol/L、10^-66 mol/L的GnRH来刺激体外培养的星形胶质细胞,作用时间为1h、4 h、8 h、12 h、24 h。后续用ELISA试剂盒法测定细胞GnIH、kisspeptin的表达水平,用qPCR测定细胞GnIH、kisspeptin mRNA表达水平。结果显示,浓度为10^-10 mol/L的GnRH,作用8h后GnIH、kisspeptin的表达与对照组相比差异显著（P<0.05）。最后选取的GnRH适宜浓度为10^-10 mol/L,作用时间为8h。（4）为了探究GnRHR-Ras-MAPK通路在GnRH调节星形胶质细胞GnIH和kisspeptin表达中的作用。首先筛选适宜的抑制剂浓度。GnRHR与Ras抑制剂浓度均先选取5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L。预处理细胞1h后用浓度为10^-10 mol/L的GnRH处理,作用8h。用ELISA试剂盒法测定培养液中GnIH和kisspeptin的表达水平。结果显示,在GnRHR抑制剂的浓度为10μmol/L、Ras抑制剂浓度为20μmol/L时GnIH和kisspeptin的表达水平与对照组相比有较大变化,差异显著（P<0.05）。实验最终选取GnRHR抑制剂浓度为10μmol/L、Ras抑制剂浓度为20μmol/L。参考之前实验,选取p38抑制剂浓度、JNK抑制剂浓度、ERK抑制剂浓度为分别为20μmol/L、20μmol/L、10μmol/L。实验设置分组为空白对照组、GnRH对照组、通路抑制剂组、通路抑制剂+GnRH组,通路抑制剂预处理星形胶质细胞1h后加入浓度为10^-10 mol/L的GnRH,再作用8h。用Weston-blot法测定各通路蛋白表达水平或磷酸化水平。用ELISA法测定细胞GnIH和kisspeptin的表达水平。用qPCR法测定细胞GnIH和kisspeptin的mRNA表达水平。结果显示处理后通路蛋白的表达量或磷酸化水平都有显著差异（P<0.05）,并且GnIH和kisspeptin的蛋白表达和mRNA表达也有明显变化,差异显著（P<0.05）。综上所述,本实验可得到以下结论:（1）GnRH影响星形胶质细胞活性,高浓度10^-6mol/L的GnRH会抑制细胞活性,低浓度10^-12mol/L的会GnRH促进细胞活性。10^-10 mol/L的GnRH能有效激活星形胶质细胞,显著提升星形胶质细胞的活性。（2）GnRH调节星形胶质细胞GnIH和kisspeptin的表达,高浓度10^-6mol/L的GnRH促进细胞GnIH表达,抑制细胞kisspeptin表达;低浓度10^-12mol/L的GnRH抑制细胞GnIH表达,促进细胞kisspeptin表达。10^-10 mol/L的GnRH,作用8h后星形胶质细胞中GnIH和kisspeptin的表达变化最为显著。（3）GnRH经GnRHR-Ras-ERK通路调控星形胶质细胞GnIH的表达,经GnRHR-Ras-MAPK调控星形胶质细胞kisspeptin的表达。