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IRF-4结合蛋白IBP是新近发现与免疫突触形成、T淋巴细胞激活及Th1/Th2极化关系密切的一个新分子。通过对IBP缺失小鼠的观察,发现动物出现SLE样自身免疫反应,特征为血清IgG水平明显升高、自身抗体产生、效应T细胞和记忆T细胞积聚,但具体通过何种途径引发疾病的机制未明。由于细胞凋亡在多细胞生物发育、自稳态维持以及免疫保护和免疫调控中起着重要的作用,多种自身免疫疾病的发生发展均与免疫细胞凋亡紊乱及其引发的免疫自稳失衡相关,本研究拟应用siRNA技术构建IBP低表达T细胞株,通过研究激活状态下凋亡的改变及引起改变的凋亡分子和通路,确定IBP低表达对T细胞凋亡的影响及其作用机制,为阐明IBP缺失引发自身免疫病的分子机制研究奠定基础。主要研究内容和结果1. IBP siRNA稳定表达载体的构建根据生物信息学分析,设计并合成IBP的三对siRNA靶位点序列和一对无关序列作为阴性对照,构建GeneBuster siRNA重组载体。利用firefly luciferase和renilla luciferase双荧光报告基因系统,将IBP cDNA全长克隆入pTRE- firefly luciferase基因5’端,检测IBP抑制效率。通过检测筛选出一条对IBP抑制效率为78%的有效序列(siRNA 178)。2.建立IBP基因沉默细胞模型(1)细胞转染:将IBP siRNA 178稳定表达载体及阴性对照NC载体转染高表达IBP的人白血病T细胞株Jurkat,利用载体的neo抗性标志,用G418的最小死亡剂量筛选获得稳定转染细胞株。(2) mRNA水平定量方法:利用IBP和管家基因β-actin的质粒标准品绘制real time PCR标准曲线,建立检测IBP的real time PCR标准曲线定量法。(3)蛋白水平定量方法:构建IBP原核表达载体PET-32a/IBP及PGEX-KG/IBP,表达纯化后以6×his-IBP融合蛋白作为免疫原,GST-IBP重组蛋白作为鉴定抗原,免疫兔制备IBP多克隆抗体,用Western blotting从蛋白水平对IBP进行定量。经荧光定量PCR和Western blotting检测,筛选所得稳定转染细胞株的抑制效率为73%,阴性对照细胞无明显抑制。3. IBP在T细胞凋亡中的作用(1) IBP低表达对TCR方式刺激下细胞增殖的影响:将IBP siRNA表达载体稳定转染的Jurkat细胞命名为J.IBP-,阴性对照NC载体稳定转染细胞命名为J.NC。用终浓度5μg/ml的固相Anti-CD3、CD28mAb刺激的TCR信号方式作用于细胞使其激活,3H-TdR掺入实验检测细胞增殖,结果显示阴性对照细胞在此刺激下的增殖受到明显抑制,J.IBP-则未受影响。(2) IBP低表达对TCR方式刺激下细胞凋亡的影响:用相同的TCR信号方式激活细胞,Annexin-v/PI双染色法对细胞进行流式检测。结果显示J.NC在此刺激下发生明显高于J.IBP-的凋亡,分析原因可能是发生了激活诱导的细胞死亡(activation induced cell death, AICD),而IBP缺失后对此凋亡产生了抵抗,由此推断IBP参与正常的细胞激活后凋亡。(3) IBP所致凋亡途径的研究:将IBP低表达细胞J.IBP-与高表达FasL的肝癌细胞SW480共培养,观察细胞的凋亡变化。SW480通过混合培养能触发淋巴细胞发生Fas途径凋亡,J.IBP-与SW480细胞共培养24h后,PI染色经流式检测,发现IBP低表达后细胞凋亡率明显降低。由此推测,IBP通过Fas凋亡途径参与细胞的正常凋亡,进而在免疫自稳调节中发挥作用。此外,将包含IBP基因全长的pEGFP-C1/hIBP重组质粒转染到HEK293T中,细胞激活后观察到有部分细胞的IBP由胞浆转运到核,提示IBP可能具有转录因子活性,参与Fas或Fas途径相关基因的转录调控。综上所述,本研究应用siRNA技术构建IBP低表达T细胞株,通过研究激活状态下凋亡的改变发现IBP低表达后能抵抗Fas途径的凋亡,由此推出IBP通过Fas途径参与T细胞激活后凋亡的调控。Fas介导的T细胞凋亡在免疫自稳、免疫调控等各种过程中均发挥着至关重要的作用,它可使免疫细胞的活化增殖和机体的免疫应答维持在一定的限度,避免发生过度免疫反应损伤机体,使机体的免疫系统处于平衡状态,进而参与免疫自稳的调节,故IBP在免疫自稳中发挥重要作用。其作用机制可能是作为转录因子进入核内参与调控Fas或相关基因的表达。本研究对于了解IBP在免疫自稳中的作用机制,探讨自身免疫性疾病的发病机理及治疗策略有着重要的意义。