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采用胶体金免疫层析技术(CGICA)和酶联免疫吸附技术(ELISA),建立了微囊藻毒素(MC-LR)的高灵敏快速检测方法,并研制出具有我国自主知识产权的高灵敏度酶免检测试剂盒和快速“金标”检测试纸条。
在研究中采用“活泼酯法”和“碳二亚胺法”,分别制备了MC-LR-KLH免疫抗原和MC-LR-BSA检测抗原。按常规方法免疫新西兰大白兔20周,经采血,饱和硫酸胺沉淀纯化得到抗MC-LR的多克隆抗体。同时,免疫Balb/c小鼠,用细胞融合和杂交瘤技术筛选,获得了高特异分泌抗MC-LR单克隆细胞株,经小鼠体内扩大培养,纯化后获得抗MC-LR的单克隆抗体。利用制备的多克隆抗体, MC-LR-BSA检测抗原,以及相应的ELISA常规试剂,建立了MC-LR的间接竞争ELISA方法,对方法的灵敏度,线性范围,特异性,重现性,误差影响因素等主要技术指标进行了考核,同时研制出了相应的检测试剂盒,考核其稳定性和回收率,并与相关的其他检测方法及国内外同类试剂盒进行了比对验证。利用制备的抗MC-LR单克隆抗体,MC-LR-BSA检测抗原以及相应的CGICT常规试剂和辅材,建立了。MC-LR的胶体金免疫层析快速检测方法,对方法的灵敏度,特异性,重现性,检测时间,误差影响因素等主要技术指标进行了考核,同时研制出了相应的“金标”快速检测试纸条,考核其稳定性和回收率。用HPLC法对其进行了比对验证。
利用多克隆抗体建立的MC-LR间接竞争ELlSA法和研制的酶免检测试剂盒,其灵敏度为0.05μg/L,检测线范围为0.1μg/L~10μg/L,拟合线性方程为Y=-202355x-0.4119,相关系数R<2>=0.9987, IC<,50>为0.65μg/L,与MC-RR交叉反应率<30%,与MC-LW,MC-LF的交叉反应率均<1%,重现性为0.86~7.21%,平均3.96%,检测时间<2.5h,有效期大于6个月,样品检测回收率为79.8~117.8%,平均为93.25%,与进口和国内同类试剂盒的比对实验结果,P>0.05,无明显差异,与HPLC方法比对,结果经CHITEST检验,为0.9996,具有良好的相关性。
利用单抗建立的MC-LR胶体金免疫层析检测技术及“金标”快速检测试纸条,最低检出限为10μg/L,重现性非常好,与MC-LF,MC-LW交叉反应率均<1%,与MC-RR的交叉反应率<20%,试纸条检测时间<10min,有效期>10个月,样品检测回收率为76.9-83.3%,与HPLC方法进行阴性阳性样品检测结果比对,总符合率为95%。