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肝脏是人体内负责蛋白合成、代谢物转化和异源物质解毒等重要功能的内脏器官,由肝脏代谢性疾病和爆发性肝衰竭等引起的终末期肝病是严重危害全世界人类健康的重大疾病之一。目前治疗终末期肝病的唯一有效手段是肝移植,但面临着供体肝脏稀缺和免疫排斥等问题。尽管以肝细胞为基础的细胞替代治疗以及生物人工肝和组织工程肝脏等辅助治疗设备已被广泛地应用于终末期肝病的临床治疗中,却也同样受到了功能性肝细胞来源问题的严重制约。近年来,干细胞与再生医学的快速发展为终末期肝病等重大疾病的细胞治疗带来了新的希望。多能干细胞(Pluripotent stem cells,PSCs)包括胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs),具有高度自我更新能力和向几乎所有细胞类型分化的潜能,具有重要的临床应用价值。人们模拟胚胎发育过程,利用各发育阶段所需的细胞因子能够将多能干细胞诱导分化成肝细胞,这些研究为多能干细胞来源的肝细胞应用于终末期肝病的治疗带来了希望,但是仍然存在很多问题。首先,ESCs和iPSCs都有成畸胎瘤的风险,这是ESCs或iPSCs来源的功能细胞应用于临床治疗存在的一个重要安全隐患。其次,目前大部分干细胞来源的肝细胞表型均与未成熟胎肝细胞相似,无法达到原代成年肝细胞的成熟度。此外,ESCs和iPSCs的全能性导致在向所需细胞类型分化的过程中会同时产生各种其他胚层的细胞类型,难以获得高纯度、单一谱系的目的细胞。基于iPSCs重编程的思路,人们建立了将一种细胞直接重编程为另一种细胞类型的方法,即谱系重编程技术。近期有多个团队分别从对肝脏发育成熟非常关键的转录因子中筛选出不同转录因子组合,通过在成纤维细胞中过表达这些转录因子,成功地实现了人和小鼠来源成纤维细胞向肝细胞以及小鼠成纤维细胞向肝干细胞的直接细胞类型转化。此外,还可以通过瞬时表达多能性转录因子先将成纤维细胞重编程到内胚层祖细胞阶段,再利用细胞因子和小分子化合物将其分化成肝细胞。这些完全或部分依赖于转录因子的重编程策略为基于细胞的临床治疗带来了希望,但是对基因进行操作的方式所存在的潜在风险限制了其临床应用。小分子化合物具有稳定、可控、廉价和安全的特性,在细胞重编程中的应用非常广泛。单纯使用小分子化合物实现了小鼠成纤维细胞向iPSCs的重编程以及小鼠和人的成纤维细胞向神经细胞的直接转化,这种完全使用化合物的重编程方式为细胞重编程提供了更为安全稳定的策略。然而,目前为止人们仍未能够实现利用小分子化合物重编程的方式获得任何一个胚层的干/祖细胞。在本研究中,我们选取与肝脏发育同源的消化道上皮细胞作为起始细胞,利用小分子化合物将其重编程为诱导人内胚层祖细胞(Human induced endodermal progenitor cells,hiEndoPCs),然后将hiEndoPCs诱导分化为功能性肝细胞。我们首先建立了从胃肠手术或胃肠镜活检标本中分离培养原代上皮细胞和基质细胞的方法。发现在胃基质细胞作为饲养层细胞的支持作用下,利用Bay K 8644、Bix01294、RG108和SB431542这四个小分子化合物的组合能够将胃上皮细胞和十二指肠上皮细胞高效地谱系重编程为hiEndoPCs。hiEndoPCs表达内胚层干/祖细胞标志性基因GATA4、FOXA2、SOX9、HNF1B、PDX1、ONECUT2和HOXA3,且在全基因组转录水平和表观遗传水平上具有内胚层干/祖细胞特性,hiEndo PCs可能是一种发育阶段介于原肠管(Primitive gut tube,PGT)和后肠后段(Posterior foregut,PFG)之间的特殊的内胚层祖细胞。hiEndoPCs在体外具有一定的增殖能力,能够在无饲养层培养条件下进行传代和扩增,经过冻存和复苏后hiEndoPCs能够维持其生长特性和分化潜能。在肝细胞诱导分化条件下,hiEndoPCs可以在体外分化为表达成熟肝细胞标志性基因的肝细胞样细胞(hiEndoPC-Heps)。DNA甲基化分析显示TF、CYP2E1、APOBEC1等肝系特异性基因的启动子区域在hiEndoPC-Heps中处于低甲基化状态。RNA-seq数据显示在hiEndoPC-Heps中有大量与肝脏发育和成熟、脂肪酸代谢、葡萄糖代谢、脂蛋白代谢以及药物代谢相关的基因表达显著上调。更重要的是,hiEndoPC-Heps在体外具有糖原和脂滴储存、靛青绿和低密度脂蛋白摄取、白蛋白分泌和CYP3A4代谢等肝细胞功能,而且在体内能够整合到肝损伤小鼠肝脏中并发挥生物学功能。hiEndoPCs在体外还能够诱导分化形成表达胰腺发育关键性转录因子NKX6.1、PDX1、NGN3和胰腺特异性基因GCG、INS、SST的胰腺内分泌细胞,以及表达CDX2、VIL1、MUC2、CHGA和LYSO的肠上皮细胞。此外,hiEndoPCs还具有向肺上皮细胞和甲状腺上皮细胞分化的潜能。然而hiEndoPCs在体内和体外均不具备向中胚层和外胚层分化的潜能,表明其分化潜能限制在内胚层。最后,我们对hiEndoPCs的安全性进行了评价,发现hiEndoPCs在体外传代扩增后核型保持正常,而且在体内不能形成畸胎瘤。综上所述,本研究实现了单纯使用小分子化合物将人消化道上皮细胞谱系重编程为具有一定增殖能力、分化潜能限制在内胚层而且无致瘤性风险的内胚层祖细胞,并将其诱导分化获得功能性肝细胞,为基于肝细胞的细胞替代性治疗、药物筛选提供了更为安全有效的新型种子细胞来源。