论文部分内容阅读
牛结核病是一种由牛结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病。牛结核病传统诊断方法为牛结核菌素(PPD)皮内变态反应试验,但PPD存在与其它分支杆菌的抗原交叉反应影响了该方法的特异性。编码CFP10、ESAT6两蛋白的基因仅存在于牛结核分枝杆菌中,禽结核、副结核等分枝杆菌则无这两种基因,两蛋白为良好的牛结核病诊断候选抗原。本研究以牛结核分支杆菌C68001基因组DNA为模板,采用基因拼接(Gene SOEing)技术,经重叠PCR扩增获得cfp10-esat6融合基因,并克隆到pET32a(+)表达载体,构建了重组质粒pET32a(+)-cfp10-esat6,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,得到43KD的可溶性目的蛋白,在最佳表达条件下,表达量可达总蛋白的42%。Western blot试验表明,重组蛋白CFP10-ESAT6可被牛结核阳性血清识别。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化,其纯度可达90%。用纯化的重组蛋白对经牛结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌致敏的豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)试验,结果表明,1μg重组蛋白可以诱导牛结核分枝杆菌致敏的豚鼠产生与10IUPPD相当的DTH(红肿平均直径为1.34cm)。而重组蛋白诱导禽结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌致敏豚鼠的DTH较弱(红肿平均直径为0.30cm),能特异地区分牛结核致敏分枝杆菌与禽结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌致敏的豚鼠。用纯化的重组蛋白和PPD同时对40头牛进行临床检测,结果表明,16μg重组蛋白可以诱导牛结核感染牛产生强烈的DTH反应,与牛PPD皮试结果符合率达到85%。分别以重组蛋白和PPD作为刺激原进行牛结核病γ干扰素ELISA检测试验,2μg融合蛋白可以刺激全血产生高水平的γ干扰素,与PPD作为刺激原的检测结果相比符合率为90%。结果表明,重组蛋白作为临床牛皮试反应的检测试剂以及IFN-γELISA反应的刺激原均具有很高的敏感性,该重组蛋白作为牛结核诊断试剂具有良好的应用前景。