【目的】　　 1．采用新一代高通量测序技术分析多重耐药细菌质粒的耐药基因分布。　　 2．研究本实验发现的blaKluc新基因型的耐药性。　　 3．分析blaKluc基因的多样性、系统发育及结构特征。　　 【方法】　　 1．提取320株耐药大肠埃希菌（温州医学院附属第一医院）质粒DNA，送去深圳华大基因研究院进行solexa测序，通过SOAPdenovo软件对测序结果进行拼接分析，用blast软件对拼接结果进行耐药基因型分析。　　 2．根据高通量测序筛选到的blaKluc新基因型的保守区设计鉴定引物，以10种共计1100株的细菌基因组作为模板，利用PCR技术大规模筛选blaKluc基因。　　 3．通过对携带blaKluc基因菌株的质粒进行PCR鉴定以及质粒接合转移实验对本实验新发现的两个blaKluc新基因型进行初步的亚细胞定位。　　 4．扩增带有NOTI和BamHI双酶切位点的blaKluc基因，构建blaKluc/pMD-18T载体保存基因片段，并测序（上海鼎安）。进一步构建blaKluc/pET-28(a)原核表达载体，转化入E.coliBL21实现表达，通过多个IPTG浓度梯度以及时间梯度的诱导，确定最佳诱导表达条件。　　 5．通过blast以及其他相关软件在核酸水平和氨基酸水平比对分析我们发现的两个新基因型以及已经公布的两条基因，分析其突变位点，保守区域，建立进化树，分析同源性。通过SMART、ScanProsite、TMHMM-2.0、SignalP3.0、ServerPSORTⅡ、Interproscan、SWISS-MODEL、Theoretical分析该基因的等电点，跨膜结构，信号肽，以及二级三级结构的预测。　　 6．琼脂稀释法检测携带blaKluc基因原始菌株E.coliD41、blaKluc克隆株、pET-28(a)空载株、E.coliD41/E.coliEC600(rif+)接合子、E.coliBL21空白株以及质控菌株ATCC25922对32种临床常用抗生素的MIC。与已报道的blaKluc基因耐药情况对比。　　 【结果】　　 1．发现2个blaKluc新基因型，分别来自EcoliD41和E．cloacaeY214菌株。　　 2．成功构建blaKluc/pET-28(a)原核表达载体，并确定最佳表达条件。　　 3．初步确定2个blaKluc新基因型定位在质粒上。　　 4．证实本实验发现的blaKluc新基因型与细菌多重耐药有关。　　 5．两个新基因型之间只有两个氨基酸不同，二者与Kluc-2有三个氨基酸不同。　　 6．预测blaKluc基因翻译后肽链的结构特征以及蛋白三级机构。　　 【结论】　　 在方法学上表明solexa测序技术可以用来分析多重耐药细菌的质粒基因组的耐药基因分布及遗传变异规律，即便在没有精确参照序列的情况下，同样可以检测和发现样本中存在的基因型。通过质粒接合转移实验，对携带blaKluc菌株的质粒进行PCR鉴定，初步确定该基因在质粒上。成功构建blaKluc基因克隆表达载体并对其进行药敏检测，确定我们发现的blaKluc新基因型确实是与细菌多重耐药性有关的。我们发现的两个基因型之间只有一个氨基酸不同。与之前公布的两个基因也只有三个氨基酸不同。对比分析四条序列，核心功能区并未发生突变，之前公布的基因其耐药性检测结果与本实验一致，这也验证其核心功能区确实没有改变。生物信息学的分析表明该基因有跨膜信号肽，翻译的蛋白定位于细菌周质，属于分泌蛋白。生物信息学的预测分析对实验操作有着重要的指导作用，然后信息学的结论也还需要实验去验证。