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背景:皮肤为身体重要的大型器官,其暴露于体表,因此是最容易受到损害的。根据不完全统计,我国每年仅烧伤病人就有500至1000万人。仅有少数人创面易于愈合,大部分人创面难愈合或形成严重瘢痕,严重影响生活质量。目前,对于创面愈合大多数方法是促进创面愈合速率,没有从再生医学角度研究,促使组织再生达到功能性修复。皮肤中干细胞是组织再生修复的关键,而干细胞动员、增殖、迁移、分化的确切机制尚不十分清楚。根据我们前期研究实验证实α-促黑素及受体高表达于干细胞富集区域,且MSH/MC1R在创面愈合中的时空表达特性有相似之处。那么MC1R是否表达于皮肤表皮干细胞及是否分泌α-MSH,从而调控表皮干细胞增殖、迁移和分化,进而促进皮肤创面的愈合呢?本研究为探讨这一问题展开,借此为探寻表皮干细胞在创面修复过程中的作用及其调控机制提供新的思路。方法:本次研究分为体内、体外试验,从基因水平、蛋白水平、定性、定位、定量不同角度开展。1.体外试验:(1)分离与培养出生一天大鼠皮肤中表皮干细胞,通过细胞免疫荧光方法将表皮干细胞干性标志K19、β1Integrin与MC1R共染细胞原位表达鉴定表皮干细胞是否表达MC1R;(2)将培养大鼠表皮干细胞裂解提取细胞总RNA,并利用RT-PCR及扩增产物测序方法在基因水平检测表皮干细胞是否表达MC1R及α-MSH。2.体内试验:选择6-8周清洁级健康SD雄性大鼠,制作大鼠背部皮肤创伤模型,分别于1、3、5、7、14、21天处死大鼠后切取圆形创面及周边2mm正常皮肤,将取下皮肤对半分开。一半立即液氮速冻碾碎提取皮肤总RNA,使用定量PCR技术在基因水平定量检测大鼠创面愈合过程中MC1R、干性基因K19、β1Integrin的动态变化。另一半创面皮肤组织多聚甲醛固定后石蜡包埋,切片进行HE染色和免疫组织化学染色在大鼠皮肤中原位表达检测创面愈合过程中MC1R表达阳性细胞的动态变化。以及组织免疫荧光方法原位检测皮肤中干细胞是否表达MC1R。结果:1.细胞免疫荧光结果示:大鼠表皮干细胞干性基因K19、β1Integrin与MC1R共染都在同一部位有阳性信号。RT-PCR检测表皮干细胞在基因水平表达MC1R、POMC、PC1、PC2、7B2。并将扩增产物测序后在Pubmed中与原基因序列比对重合率达99%。2.大鼠创面皮肤HE染色示:皮肤创面愈合经历了止血期、炎症反应期、细胞增殖期、组织重塑期。与之相对应进行MC1R免疫组化染色观察到在不同愈合期时间点MC1R表达部位不同。创伤后第一天,处于炎症反应期,炎性细胞迁移聚集到伤口边缘,MC1R表达于伤口边缘基底层细胞、炎性细胞及周围正常皮肤毛囊中,而在正常皮肤皮肤基底层中没有检测到阳性信号;随着创面愈合第3天开始处于细胞增殖期,HE染色明显观察到皮肤基底层细胞向伤口聚集迁移的趋势,而在免疫组织化学染色中可见到这些在创面边缘聚集迁移的细胞表达MC1R呈现强阳性信号,并且随着创面愈合,这些细胞不断延生形成皮肤新的基底层。直至创面愈合14天、21天,可观察到创面完全封闭,新生成表皮完全连接两侧正常皮肤。MC1R在新基底层中无阳性信号,只在正常皮肤毛囊中检测到。3.皮肤免疫荧光共染色技术在皮肤中原位检测表皮干细胞是否表达MC1R。结果可知:在表皮干细胞表达干性基因K19显示为绿色信号,MC1R为红色信号,二者在同一部位细胞能够重合。4.从定量PCR结果获知,大鼠创面愈合过程中,MC1R、干性基因K19、β1Integrin均呈现抛物线变化。愈合第三天开始表达量逐渐增高,到皮肤创面基本愈合时候表达量逐渐降低至正常水平。结论:1.大鼠分离培养及皮肤组织体内原位表皮干细胞表达MC1R,但是介于表皮干细胞无特异性的标志物,因此还需进一步实验使用更多的干性标志物与MC1R共染,及采用不同的试验方法从不同角度验证。2.皮肤创面愈合过程中,MC1R表达部位变化说明其参与了创面愈合过程,并且与干细胞参与创面愈合过程有共同变化趋势。但是在皮肤愈合中表达MC1R阳性细胞是否是干细胞及动态迁移过程并不清楚,还需进一步实验追踪。以及α-MSH对于创面愈合有何影响还需进行体内、体外实验继续验证。