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广西是中国最大的甘蔗生产基地,甘蔗是中国最重要的糖料作物和极具潜力的能源作物,但广西的蔗区主要分布在旱坡地,约90％蔗区基本无灌溉条件,干旱严重影响甘蔗生长,干旱是制约甘蔗生产的最重要的因素。
干旱胁迫和逆境信号分子可激发“胁迫蛋白”表达以适应胁迫环境,对“胁迫蛋白”结构和功能的研究是揭示作物适应干旱逆境基因表达的重点,蛋白质组学方法和技术是系统研究“胁迫蛋白”表达和结构功能的有效手段。
论文以抗旱性不同的两个甘蔗品种(ROC22与ROC16)为试材,砂培育苗至苗期茎高约25cm,采用含100g/L聚乙二醇6000(PEG6000)的Hoagland营养液进行模拟干旱造成的渗透胁迫处理,并同时进行PEG渗透胁迫条件下叶面喷施乙烯利(100mg/L)处理。主要采用蛋白质组学方法和技术分离、鉴定和分析甘蔗幼苗在渗透胁迫和乙烯利处理下发生变化的蛋白质,探讨甘蔗幼苗抗旱和乙烯利调控甘蔗抗旱机理,主要结果如下:
1.渗透胁迫引起2个甘蔗品种幼苗叶片内肽酶活性升高;渗透胁迫早期蛋白质含量出现增加,但随着时间的延长,蛋白质含量均出现明显下降;渗透胁迫下抗旱性强的甘蔗品种ROC22叶片蛋白质含量稳定性大于抗旱性弱的甘蔗品种ROC16。
2.SDS-PAGE显示,对渗透胁迫响应最快的是甘蔗品种ROC16的17.6KDa、23.7KDa和24.9KDa蛋白条带,胁迫开始2h就显著上调,并且23.7和24.9KDa蛋白条带胁迫后期变化活跃;而甘蔗品种ROC22除18.4KDa和95.4KDa蛋白条带在8h和14h显著上调,37.1KDa蛋白条带在5h到14h显著上调外,其他大部分蛋白在渗透胁迫相当长时间保持稳定,后期才显著下调,说明渗透胁迫下抗旱性强的甘蔗品种ROC22叶片蛋白质组成稳定性大于抗旱性弱的甘蔗品种ROC16;渗透胁迫14h处理是蛋白质代谢相对活跃变化时期。
3.综合比较SDS提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚抽提法3种蛋白质提取方法显示,酚抽提法蛋白沉淀纯度高、复溶性好、蛋白质溶液浓度高,是适合双向电泳分离甘蔗叶片蛋白质的较理想方法,并对双向凝胶电泳(2-DE)分离条件进行了优化。
4.2-DE和MALDI-TOF-MS分析结果显示,两个甘蔗品种渗透胁迫和乙烯利处理均显著上调表达蛋白为Drought inducible22kDa protein;生物信息学分析显示该蛋白属于ASR蛋白家族成员,是由142个氨基酸组成,富含谷氨酸和不稳定的酸性亲水非跨膜蛋白,富含α螺旋结构,此蛋白可作为甘蔗抗旱和乙烯利提高甘蔗抗旱性特征蛋白。
5.2-DE结果和质谱鉴定结果表明,两个甘蔗品种中渗透胁迫均下调表达蛋白为与抗氧化次生代谢相关的Isoflavone reductase-like(IRLs)和ATP synthase delta chain,表现出渗透胁迫对抗氧化次生代谢和ATP合成的影响。
6.蛋白质组学研究结果显示,甘蔗叶片光合作用相关的Oxygen-evolving enhancerprotein2(OEE2)是由259个氨基酸组成的富含丙氨酸、稳定的亲水跨膜蛋白,两个甘蔗品种渗透胁迫下OEE2无显著变化,但乙烯利可显著提高OEE2的表达量。
7.差异蛋白质组学研究结果表明,渗透胁迫下抗氧化相关的Chain A,crystalstructure of the complex between ferredoxin and ferredoxin-NADP+reductase(Fd-FNRchain A)和ATPase CF1 subunit beta表达量在抗旱性强的甘蔗品种ROC22中无显著改变,但在抗旱性弱的甘蔗品种ROC16中显著下调;另外,渗透胁迫下光合作用相关的Rubisco small sub在抗旱性强的甘蔗品种ROC22中显著上调,但在抗旱性弱的品种ROC16中显著下调;说明渗透胁迫下抗旱性强的甘蔗品种ROC22的抗氧化系统、能量代谢以及光合作用稳定性可能大于抗旱性弱的甘蔗品种ROC16。
8.抗旱性强的甘蔗品种ROC22中Drought inducible22kD protein蛋白和ATPaseCF1 subunit beta蛋白的相对丰度高于抗旱性弱的甘蔗品种ROC16,这两种蛋白有可能可作为不同甘蔗品种抗旱性标志蛋白。
9.在两个甘蔗品种中均观察到渗透胁迫下乙烯利处理可以抑制内肽酶活性,提高Drought inducible22kD protein、IRLs、ATPase CF1 subunit beta、OEE2、Fd-FNR chainA高表达从而提高甘蔗的抗旱性,其中Drought inducible22kD protein为乙烯利调控甘蔗抗旱效果最明显的蛋白。