糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是以血液中葡萄糖水平升高为主要特点的一种终生进行性代谢疾病,糖尿病患者中近95%是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者,持续的高血糖不断地攻击全身各个微血管和大血管,导致了各种并发症的出现。而糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是其中最常见和最严重的微血管并发症之一。据统计约有5%～10%的2型糖尿病患者最终会发展为DN,虽然比例不高,但是2型糖尿病患者数目庞大。DN起病十分隐匿,随着病程的延长和病变的逐渐深入,最终发展为终末期肾脏疾病(end-stage renal disease, ESRD),患者只能依靠血液透析等替代治疗方式来维持生命。DN已经成为糖尿病病人死亡的重要原因之一。因此,研究DN的发病机制,寻找有效的预防和治疗措施,具有重大的研究意义。二十二碳六烯酸(Docosahaexaenoic acid, DHA),属于n-3系多不饱和脂肪酸,含有6个碳碳双键,不饱和度很高,在体内极易被其他氧化物质氧化而生成一系列的次级代谢产物。大量研究证明DHA及其代谢衍生物具有抗氧化应激,抗炎,参与细胞膜构成,增加细胞膜流动性,调节离子通道和调节基因表达等多种重要的生物学功能。目前,对于DN的具体发病机制,还不是很明确。T2DM和DN患者机体DNA的氧化水平如何?DNA的氧化损伤在T2DM肾损伤中的作用如何?饮食中添加DHA会对T2DM肾脏中DNA的氧化水平有何影响?能否有效地缓解T2DM所引起的肾组织损伤?DHA又是通过何种分子机制对T2DM肾脏DNA的氧化损伤造成影响的呢?为了解决上述问题,本研究进行了以下实验：第一,建立了测定尿液中8-OHdG的生化分析新方法,并应用该方法分析检测了CON组、T2DM组和DN组的DNA氧化损伤水平。第二,通过动物模型实验考察了DHA对T2DM大鼠肾脏DNA氧化损伤的影响。为临床应用DHA辅助防治DN提供了实验依据和理论基础。第一部分DNA氧化损伤生物标记物8-OHdG毛细管电泳分析新方法的建立目的：为下一步研究T2DM和DN患者机体的DNA氧化水平奠定方法学的基础。方法：固相萃取结合胶束毛细管电泳紫外检测法。结果：本研究建立了一种固相萃取结合胶束毛细管电泳检测尿液中8-OHdG的新方法。通过优化SPE萃取条件和MEKC分离条件,在最佳条件下,8-OHdG浓度在1到500μg L-1之间线性良好,LOD(S/N=3)为0.27 g L-1,LOQ(S/N=10)为0.82μg L-1。该方法检测尿液中8-OHdG的日间精密度和日内精密度的相对标准偏差分别为5.6%和4.3%,(健康儿童尿液加标)回收率在99.8%-103.2%之间。该方法弥补了CE-UV在测定痕量组分方面的不足。小结：建立了一种简单,灵敏,快速的检测尿液中8-OHdG的新方法,为机体DNA氧化损伤水平的测量提供了一种新的途径。第二部分DNA氧化水平与2型糖尿病肾损伤之间相关性的研究目的：探讨2型糖尿病患者肾损伤与DNA氧化的关系。方法：1应用第一部分新建的以及本室原有的毛细管电泳检测方法测定并分析CON组、T2DM组和DN组尿液中的8-OHdG和creatinin；2对尿液中8-OHdG/creatinine比值与其他临床生化指标之间进行person相关性分析。结果：DN组患者尿液中8-OHdG/creatinine(45.14±12.68 μg/g)显著高于CON组(11.72±2.38μg/g)和T2DM组(16.37±4.97μg/g),尿液中8-OHdG/creatinine的水平与尿酸(UA)值无显著相关性,与糖化血红蛋白和24小时尿蛋白排泄量之间有显著正相关性。小结：DN组患者肾损伤与DNA的氧化有关第三部分DHA通过降低DNA氧化水平缓解2型糖尿病大鼠的肾损伤目的：探讨DHA是否可通过降低氧化应激及DNA的氧化来改善T2DM的肾损伤。方法：1高脂饮食加小剂量STZ诱导T2DM大鼠,并经饮食补充DHA；2利用生物化学和病理学方法检测大鼠肾脏功能相关的生化指标和肾组织结构,评价DHA对肾脏功能的影响；3利用组织荧光和生物化学方法,测定大鼠肾脏组织的ROS水平、脂质过氧化水平、DNA的氧化损伤,确定DHA能否改善T2DM肾脏组织的氧化应激,脂质过氧化以及DNA损伤；4使用生物化学的方法检测大鼠肾脏组织的重要抗氧酶活性和重要的抗氧物质的含量,确定DHA对T2DM大鼠肾脏组织的抗氧化系统的影响；5采用Real time PCR检测饮食添加DHA对T2DM大鼠肾脏三大抗氧化系统主要相关抗氧酶nRNA表达水平的影响；6Western blot检测饮食添加DHA对T2DM大鼠肾脏组织中NADPH氧化酶重要亚基的蛋白表达水平的影响。结果：1 DHA降低了T2DM大鼠24小时尿蛋白的排泄率32周干预结束时,DM组大鼠的24小时尿蛋白排泄率(1893.9±948.8ng)显著高于对照组(477.5±197.1 ng)(P<0.05)；而DHA组大鼠的24小时尿蛋白排泄率(1133.9±542.7 ng)明显低于DM组(P<0.05),但显著高于CON组(P<0.05)。2 DHA改善了T2DM大鼠肾脏组织结构的损伤H&E染色结果显示：CON组大鼠肾脏未见明显的肾组织病理学变化,肾小球边缘齐整,结构正常,分布较均匀,细胞核排列较为整齐,肾小管形态清晰。DM组大鼠肾小球分布不均匀,细胞核排布散乱,肾小管上皮细胞出现水肿,基质弥漫性增多,肾小球体积增大,平均肾小球截面积明显高于CON组。DHA组介于以上两者之间,较DM组有所改善。3 DHA改善了T2DM大鼠肾脏组织的DNA损伤3.1 DHA降低了T2DM大鼠肾小管内8-OHdG的含量肾脏组织石蜡切片免疫荧光结果显示在肾小管内8-OHdG的含量DM组明显高于CON组和DHA组。说明饮食中添加DHA可有效减少T2DM大鼠肾脏肾小管内8-OHdG的生成。3.2 DHA缓解了T2DM大鼠肾脏组织核DNA的凋亡DM组肾脏组织切片TUNEL染色显示凋亡的强度明显高于CON组和DHA组,说明饮食中添加DHA可有效缓解T2DM大鼠肾脏内的细胞凋亡4 DHA降低了2型糖尿病大鼠肾脏组织的氧化应激水平4.1 DHA降低了2型糖尿病大鼠肾脏组织的ROS水平DHE染色法和荧光分光光度检测法的检测结果一致显示：DM组大鼠肾脏组织中的ROS水平显著高于CON组(P<0.05)；而DHA组大鼠肾脏组织中的ROS水平明显低于DM组(P<0.05),而与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。4.2 DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织中TADPH氧化酶重要亚基在nRNA水平及蛋白水平上的表达在高血糖条件下TADPH氧化酶可以诱导产生ROS。Real time PCR结果显示DHA可通过下调NADPH氧化酶的Nox2, Nox4口P22 phox亚基基因在1nRNA水平上的表达来增强糖尿病大鼠肾脏组织的抗氧化能力。Western Blot结果显示DHA可通过下调NADPH氧化酶的Nox2, Nox4, P22 phox和p-P47 phox亚基基因的蛋白表达水平来降低糖尿病大鼠肾脏组织的ROS水平。5DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织脂质过氧化物的含量5.1 DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织脂质过氧化物MDA的含量MD A是膜脂质过氧化的重要的产物之一,它的产生能加剧细胞膜系统的损伤程度。DM组肾脏组织匀浆液中MDA的含量为(1.20±0.18nmol/mg prot)明显高于CON组(0.86±0.13 nmol/mg prot)和DHA组(1.01±0.19 nmol/mg prot),说明饮食中添加DHA可有效减少T2DM大鼠肾脏内脂质过氧化物MDA的生成。5.2 DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织肾小管内4-HNE含量在体内4-HNE是n-6系多不饱和脂肪酸过氧化的产物,大鼠肾小管内4-HNE的含量DM组显著高于CON组和DHA组；而肾小球内4-HNE的含量,DM组和DHA组均显著高于CON组,但DM组和DHA组之间没有统计学差异。这说明饮食中添加DHA能够有效抑制T2DM大鼠肾小管内的n-6系脂肪酸的过氧化。6 DHA提高了T2DM大鼠肾脏组织的抗氧能力6.1 DHA提高了T2DM大鼠肾脏组织的总抗氧能力(T-AOC)DM组肾脏组织匀浆液中T-AOC(1.03±0.23 U/mg prot)明显低于CON组(1.39±0.41 U/mg prot)和DHA组(1.31±0.28 U/mg prot),说明饮食中添加DHA可有效增加T2DM大鼠肾脏的总抗氧能力。6.2 DHA提高了T2DM大鼠肾脏组织内谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白还原酶等抗氧酶的活性实验检测了三组大鼠肾脏组织匀浆液中谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶和硫氧还蛋白还原酶等重要的抗氧酶的酶活性,结果显示饮食中添加DHA可有效增加T2DM大鼠肾脏内谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白还原酶的活性。6.3 DHA增加了T2DM大鼠肾脏组织内谷胱甘肽的含量结果显示,DM组肾脏组织匀浆液中GSH的含量(0.0062±0.0035μM/g Tissue)明显低于CON组(0.0213±0.0049μM/g Tissue)和DHA组 (0.0112±0.0037μM/g Tissue),说明饮食中添加DHA可以有效增加T2DM大鼠肾脏内还原型谷胱甘肽的含量。6.4 DHA增加了T2DM大鼠肾脏组织内4-HHE的含量4-HHE是n-3系多不饱和脂肪酸(主要是DHA)过氧化的产物,实验结果显示4-HHE在肾小球和肾小管内的含量变化趋势一致,DHA组的4-HHE含量显著高于DM组和CON组。这说明DHA可以作为抗氧剂通过自身氧化来降低肾脏组织的氧化损伤。7 DHA可以上调 SOD1、Gpx1和Gpx4-1等基因在1nRNA水平上的表达。小结：1 DHA改善了T2DM大鼠的肾功能和肾组织损伤。2 DHA通过增加抗氧酶的活性以及自身氧化从而降低了T2DM大鼠肾组织DNA的氧化损伤和氧化应激水平。结论：1 T2DM的肾损伤与肾脏组织内DNA的氧化损伤相关。2 DHA通过增加抗氧酶的活性以及通过自身氧化降低了T2DM大鼠肾组织的氧化应激水平和DNA的氧化损伤改善了肾功能和肾组织损伤。