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目的：通过测定TM3细胞中钟基因Bmal1及睾酮合成相关基因的节律性表达,探讨钟基因Bmal1在褪黑素抑制睾酮合成中的作用及其机制。方法：1.细胞生长动力学实验：收集处于对数生长期细胞,接种相同数量细胞于6孔板中,每天进行细胞计数,连续一周,最后计算细胞倍增时间。2.地塞米松同步细胞周期收集处于对数生长期细胞,接种相同数量细胞到60mm培养皿中,随机分为地塞米松处理组和对照组,每组设2,4,8,16,32五个时间点,每个时间点三皿细胞,待细胞生长到连接度达90%时换成无血清培养基,进行无血清培养20小时,在第20小时时加入地塞米松100nmol/L,继续培养,在加入地塞米松之后2,4,8,16,32小时收集细胞,流式细胞仪检测细胞周期。3.褪黑素处理与基因表达测定收集处于对数生长期细胞,接种相同数量细胞到60mmm培养皿中,分成对照组和褪黑素处理组,待细胞生长到连接度达90%时换成含地塞米松的无血清培养基,两小时后设为0点对照,之后每隔4小时收集细胞,直至24小时,收集0,4,8,12,16,20,24共7个时间点,褪黑素处理组在收集细胞前三个小时加入褪黑素10-6mol/L。用RT-PCR法检测各基因表达情况。Western Blot法检测蛋白表达水平。4.Bmal1基因干涉与基因表达测定使用脂质体转染RNAi质粒,使Bmal1基因低表达,之后实验分为对照组,褪黑素处理组和Bmal1低表达加褪黑素组,细胞收集方法同上。之后Elisa试剂盒检测睾酮含量,用RT-PCR法检测各基因表达情况,Western Blot法检测蛋白表达水平。结果：1.细胞Bmal1基因内源性节律诱导模型的建立细胞动力学实验结果显示细胞倍增时间为22.53士2.84 h。加入地塞米松2,4,8,16小时后细胞增殖周期无明显改,Bmall和Star基因出现节律性表达,谷值同时出现在ZT4, Bmall的峰值出现在ZT16, Star的峰值出现在ZT12。2.褪黑素处理后睾酮浓度及基因表达的改变褪黑素处理组细胞的睾酮浓度均明显低于对照组,同时节律发生改变,表现为振幅降低,峰值后移。钟基因Bmal1、睾酮合成关键调节基因Star和Hsd3b、以及Bmal1正性调控因子RORa基因的表达变化与睾酮相似。3.Bmal1基因干扰后睾酮及基因表达的改变Bmal1基因干扰后的细胞中,褪黑素处理使睾酮浓度升高,Star基因表达的节律峰值出现前移。结论：1.成功构建了睾丸间质细胞Bmal1基因内源性节律诱导模型。2.褪黑素可抑制睾丸间质细胞睾酮的分泌,其可能的机制为褪黑素通过调控钟基因Bmal1和睾酮合成关键酶Star基因的节律性表达而抑制睾酮的合成。