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猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的高度接触性、多系统出血性猪传染病。亚单位疫苗无核酸、无致病性，可以配合相应的血清学诊断方法对野毒感染和免疫接种的猪进行鉴别诊断。研究出高效的猪瘟亚单位疫苗，将对我国猪瘟防控工作具有重要的意义。目前我国还没有商品化的猪瘟亚单位疫苗，故开展了猪瘟亚单位疫苗的研究工作。
首先应用RT-PCR的方法扩增猪瘟的E2蛋白基因，然后利用融合PCR的方法在E2基因的5’端加入信号肽序列，在3’端切除跨膜区，通过在卜下游引物中加入不同的酶切位点，获得两条带有不同酶切位点的E2蛋白基因，然后把这两条基因分别克隆至pGEM-T easy载体中，筛选到阳性重组子:pT-1E2、pT-2E2，经酶切和PCR鉴定正确后，将两条E2蛋白基因依次亚克隆至二重转移载体pFASTBAC-Dual中，随机筛选得到重组转移载体分别命名为:pFBD-1E2、pFBD-2E2，其中pFBD-1E2中含有一条E2蛋白基因，pFBD-2E2中含有两条E2蛋白基因。把这两个重组转移载体进行测序，测序止确后纯化，然后分别转染至DH10bac细胞中，重组转移载体与杆状病毒杆粒发生同源重组，重组之后获得的病毒分子分别命名为:Bacmid-1E2、Bacmid-2E2。再把Bacmid-1E2、Bacmid-2E2分别转至SF9细胞中传毒3代后，对表达蛋白进行Western blot和问接免疫荧光试验(IFA)检测，对重组杆状病毒进行滴度测定，重组杆状病毒分别命名为Bacsf1E2和Bacsf2E2。
把重组杆状病毒Bacsf1E2、Bacsf2E2接种至High Five细胞进行悬浮培养，将表达条件进行优化之后，其表达量分别可达到80ug/ml和120ug/ml。把Bacsf1E2、Bacsf2E2培养液冻融3次离心去除细胞碎片，灭活后与206佐剂混合摇匀制成亚单位疫苗。用该疫苗免疫接种家兔，14d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体阻断率，Bacsf1E2疫苗为46-58％，Bacsf2E2疫苗为62-70％;二免14d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体阻断率，Bacsf1E2疫苗为72-80％，Bacsf2E2疫苗为82-86％，两次测得抗体效价均与ST传代细胞苗对照组基本持平;用ST传代细胞苗对各组兔子进行攻毒，Bacmid-1E2疫苗、Bacmid-2E2疫苗、商品化疫苗组均未出现定型热反应，而生理盐水对照组均出现定型热反应;取攻毒兔子脾脏做病理切片，由HE染色结果可以看出，生理盐水对照组兔脾脏白髓内散在部分红细胞和炎性粒细胞，红髓则出现严重出血，大量血细胞密布，并伴有大量炎性粒细胞浸润，组织坏死、细胞减少，呈现出血性梗死;商品化疫苗免疫组可见兔脾脏红髓有轻微出血现象和炎性细胞浸润，较生理盐水对照组明显缓解，未见明显淋巴细胞减少，而白髓内仅见个别红细胞;Bacmid-1E2疫苗和Bacmid-2E2疫苗免疫组可在红髓区域见少量红细胞，出血较生理盐水对照组和商品化疫苗免疫组均明显减轻，同时伴有部分炎性粒细胞浸润，虽然Bacmid-1E2疫苗和Bacmid-2E2疫苗免疫组病理观察结果均达到预期效果，但是从病理切片看，Bacmid-2E2疫苗免疫组的效果更好。用该疫苗免疫接种40-50日龄猪，25d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacmid-1E2疫苗组和商品化疫苗组的阻断率为73-77％，Bacmid-2E2疫苗组阻断率为85％.生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体;二免10d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacsf1E2疫苗组和Bacsf2E2疫苗组的血清抗体阻断率为82-90％，商品化疫苗组为76-81％，生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体;二免45天后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacsf1E2疫苗组的血清抗体阻断率均为85-93％，Bacsf2E2疫苗组的的血清抗体阻断率均为89-94％，商品化疫苗组为89-92％，生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体。二免75天后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacsf1E2疫苗组的血清抗体阻断率均为82-87％，Bacsf2E2疫苗组的血清抗体阻断率均为84-93％，商品化疫苗组为82-91％，生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体。猪瘟病毒中和试验结果显示，试验猪_次免疫E2蛋白双表达亚单位疫苗75天的时候，血清稀释64倍仍然可以中和100MID/ml的兔化弱毒。
对兔和猪进行免疫接种实验结果显示，本研究所研制的E2蛋白单表达亚单位疫苗Bacmid-1E2和E2蛋白双表达亚单位疫苗Bacmid-2E2均具有良好的免疫原性，并且对动物有很好的保护作用;与E2蛋白单表达亚单位疫苗Bacmid-1E2相比，E2蛋白双表达亚单位疫苗Bacmid-2E2不论是在免疫原性上还是对动物的综合保护上，都有更好的效果。
首先应用RT-PCR的方法扩增猪瘟的E2蛋白基因，然后利用融合PCR的方法在E2基因的5’端加入信号肽序列，在3’端切除跨膜区，通过在卜下游引物中加入不同的酶切位点，获得两条带有不同酶切位点的E2蛋白基因，然后把这两条基因分别克隆至pGEM-T easy载体中，筛选到阳性重组子:pT-1E2、pT-2E2，经酶切和PCR鉴定正确后，将两条E2蛋白基因依次亚克隆至二重转移载体pFASTBAC-Dual中，随机筛选得到重组转移载体分别命名为:pFBD-1E2、pFBD-2E2，其中pFBD-1E2中含有一条E2蛋白基因，pFBD-2E2中含有两条E2蛋白基因。把这两个重组转移载体进行测序，测序止确后纯化，然后分别转染至DH10bac细胞中，重组转移载体与杆状病毒杆粒发生同源重组，重组之后获得的病毒分子分别命名为:Bacmid-1E2、Bacmid-2E2。再把Bacmid-1E2、Bacmid-2E2分别转至SF9细胞中传毒3代后，对表达蛋白进行Western blot和问接免疫荧光试验(IFA)检测，对重组杆状病毒进行滴度测定，重组杆状病毒分别命名为Bacsf1E2和Bacsf2E2。
把重组杆状病毒Bacsf1E2、Bacsf2E2接种至High Five细胞进行悬浮培养，将表达条件进行优化之后，其表达量分别可达到80ug/ml和120ug/ml。把Bacsf1E2、Bacsf2E2培养液冻融3次离心去除细胞碎片，灭活后与206佐剂混合摇匀制成亚单位疫苗。用该疫苗免疫接种家兔，14d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体阻断率，Bacsf1E2疫苗为46-58％，Bacsf2E2疫苗为62-70％;二免14d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体阻断率，Bacsf1E2疫苗为72-80％，Bacsf2E2疫苗为82-86％，两次测得抗体效价均与ST传代细胞苗对照组基本持平;用ST传代细胞苗对各组兔子进行攻毒，Bacmid-1E2疫苗、Bacmid-2E2疫苗、商品化疫苗组均未出现定型热反应，而生理盐水对照组均出现定型热反应;取攻毒兔子脾脏做病理切片，由HE染色结果可以看出，生理盐水对照组兔脾脏白髓内散在部分红细胞和炎性粒细胞，红髓则出现严重出血，大量血细胞密布，并伴有大量炎性粒细胞浸润，组织坏死、细胞减少，呈现出血性梗死;商品化疫苗免疫组可见兔脾脏红髓有轻微出血现象和炎性细胞浸润，较生理盐水对照组明显缓解，未见明显淋巴细胞减少，而白髓内仅见个别红细胞;Bacmid-1E2疫苗和Bacmid-2E2疫苗免疫组可在红髓区域见少量红细胞，出血较生理盐水对照组和商品化疫苗免疫组均明显减轻，同时伴有部分炎性粒细胞浸润，虽然Bacmid-1E2疫苗和Bacmid-2E2疫苗免疫组病理观察结果均达到预期效果，但是从病理切片看，Bacmid-2E2疫苗免疫组的效果更好。用该疫苗免疫接种40-50日龄猪，25d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacmid-1E2疫苗组和商品化疫苗组的阻断率为73-77％，Bacmid-2E2疫苗组阻断率为85％.生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体;二免10d后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacsf1E2疫苗组和Bacsf2E2疫苗组的血清抗体阻断率为82-90％，商品化疫苗组为76-81％，生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体;二免45天后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacsf1E2疫苗组的血清抗体阻断率均为85-93％，Bacsf2E2疫苗组的的血清抗体阻断率均为89-94％，商品化疫苗组为89-92％，生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体。二免75天后用阻断ELISA抗体检测试剂盒对血清抗体效价进行检测，Bacsf1E2疫苗组的血清抗体阻断率均为82-87％，Bacsf2E2疫苗组的血清抗体阻断率均为84-93％，商品化疫苗组为82-91％，生理盐水对照组未检测到猪瘟抗体。猪瘟病毒中和试验结果显示，试验猪_次免疫E2蛋白双表达亚单位疫苗75天的时候，血清稀释64倍仍然可以中和100MID/ml的兔化弱毒。
对兔和猪进行免疫接种实验结果显示，本研究所研制的E2蛋白单表达亚单位疫苗Bacmid-1E2和E2蛋白双表达亚单位疫苗Bacmid-2E2均具有良好的免疫原性，并且对动物有很好的保护作用;与E2蛋白单表达亚单位疫苗Bacmid-1E2相比，E2蛋白双表达亚单位疫苗Bacmid-2E2不论是在免疫原性上还是对动物的综合保护上，都有更好的效果。