东亚三角涡虫Dj14-3-3ε-like基因的进化、表达和功能分析

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东亚三角涡虫(Dujesia japonica)是扁形动物门的代表动物,也是首次出现三胚层的两侧对称生物。同时,涡虫具有最为简单的神经系统和极强的再生能力和组织、器官重建能力,这些特点使涡虫已经成为研究动物神经再生的重要模型动物。14-3-3蛋白家族在基因调控中发挥作用,14-3-3ε在脊椎动物神经灰质中表达,在无脊椎动物胚胎发育参与原肠作用。本论文利用生物信息学方法研究涡虫Dj14-3-3ε-like基因在生物进化上的地位,利用Northern杂交、整体原位杂交等分子生物学手段来研究涡虫不同时期Dj14-3-3ε-like基因的表达情况,以期了解涡虫Dj14-3-3ε-like基因在胚胎发育、涡虫成虫和再生过程中的表达图式,从而从分子水平上进一步了解再生机理和调控机制。构建了L4440-Dj14-3-3ε-like干扰载体,通过喂食含有dsRNA的E. coli,观察表型变化,以推测Dj14-3-3ε-like基因在涡虫不同再生时期可能承担的生物学功能。  从东亚三角涡虫文库中挑选出克隆M455,经BLASTP确定隶属于14-3-3ε基因家族,具有14-3-3ε蛋白的保守结构域命名为Dj14-3-3ε-like基因。该基因cDNA由291bp组成最大开放阅读框(ORF),编码96个氨基酸。利用该基因编码的蛋白进行系统进化分析,表明东亚三角涡虫Dj14-3-3ε-like位于无脊椎动物14-3-3ε家族分枝的基部,ε亚型位于其它各个亚型的基部,推测ε亚型是动物各个亚型的原型。Dj14-3-3ε-like基因可能保留着动物14-3-3基因的最原始的功能。  利用整体原位杂交等技术研究该基因在涡虫体内的表达情况。胚胎原位杂交信号位于胚胎咽及神经系统;再生涡虫的整体原位杂交信号在神经系统上,与完整的成体涡虫表达有一致性;被干扰的涡虫的再生及非再生阶段的原位杂交结果也呈现出与完整的成体涡虫表达有一致性。RNAi实验结果表明,Dj14-3-3ε-like基因在涡虫神经系统再生过程中发挥一定作用,影响左右轴的建立,导致涡虫眼点异位。
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