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目的:子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在我国有日渐上升的趋势,且趋于年轻化,严重危害女性健康。目前针对子宫内膜癌的治疗方法主要以手术为主,辅助应用放疗、化疗以及激素等药物,但是对于晚期和复发的子宫内膜癌患者的治疗效果仍不够理想。近年来,分子靶向药物在肿瘤治疗中研究的不断深入,成为治疗子宫内膜癌的一种新手段,初步研究结果显示有一定的疗效。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种酪氨酸激酶,它参与信号通路中信号的转导,与多种肿瘤的发生发展关系密切。已有研究报道,EGFR在许多实体瘤中表达或过表达,并且和疾病进展、放化疗耐药、预后差有关。也有研究发现,在子宫内膜癌中也存在EGFR的过表达,且与子宫内膜癌的发生、发展、侵袭等密切相关。应用高选择性、高效的EGFR抑制剂,阻断EGFR信号转导系统已成为分子靶向治疗的一大方向。已有临床试验研究结果表明EGFR抑制剂在治疗肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤上已获得一定的成效。其中吉非替尼(Gefitinib)是一种具有代表性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,对许多肿瘤细胞株和动物肿瘤生长均有抑制作用,可以通过抑制此酶活性来阻断信号通路的传递,诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡,进而抑制肿瘤细胞的增殖生长。吉非替尼还可以增强细胞毒性药物的生长抑制效应,具有抗血管生成活性和抗转移特性。然而,吉非替尼对子宫内膜癌的作用有待进一步研究。本研究选用子宫内膜癌细胞Ishikawa为研究对象,在体外实验中研究吉非替尼诱导Ishikawa细胞凋亡的作用及其下游可能的信号通路,初步探讨其作用机制,为子宫内膜癌的靶向治疗提供新的思路。方法:1细胞培育:人子宫内膜癌细胞株Ishikawa,以含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基培养,另加浓度为100U/ml的青霉素及链霉素的双抗,培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内。以0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞呈单层贴壁生长,选用对数生长期进行实验。2应用MTT比色法检测不同浓度的吉非替尼对Ishikawa细胞生长的影响程度,同时在倒置显微镜下观察细胞形态,绘制细胞的生长抑制率曲线。3应用流式细胞仪(flowcytometry,FCM)检测不同浓度吉非替尼作用前后对Ishikawa细胞周期变化及细胞凋亡率的影响情况。4应用Western-Blot方法检测不同浓度吉非替尼对Ishikawa细胞p-Akt、CyclinD1蛋白水平表达的影响。结果:1吉非替尼对人子宫内膜癌细胞Ishikawa增殖的影响:不同浓度的吉非替尼(5uM,10uM,20uM,40uM)作用Ishikawa细胞24小时后抑制率分别为5.11±0.44%、10.58±0.07%、18.19±0.63%、33.03±0.46%;作用48小时后抑制率分别为7.52±0.71%、16.52±0.25%、30.42±0.55%、45.09±0.47%;作用72小时后抑制率分别为15.38±0.59%、27.78±0.22%、42.61±0.40%、57.03±0.44%。数据表明吉非替尼明显抑制Ishikawa细胞的增殖,分别随着吉非替尼浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐增加,呈时间-剂量依赖关系(P<0.05)。2吉非替尼对人子宫内膜癌细胞Ishikawa形态的影响:对照组的Ishikawa细胞形态规则,呈细长多边形,排列紧密,贴壁良好,呈对数生长。不同浓度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用Ishikawa细胞48h后,细胞出现皱缩变形,形态轮廓不清晰,细胞贴壁能力下降,脱壁悬浮。部分细胞崩解坏死。部分细胞出胞浆内出现空泡,呈现出细胞核浓缩、核碎裂等凋亡特征。贴壁细胞的密度明显少于对照组,凋亡细胞的数目多于对照组。3吉非替尼对Ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响:不同浓度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用于Ishikawa细胞48小时后,细胞凋亡情况如下:对照组为0.45±0.18%,实验组分别为2.47±0.64%、7.42±1.38%、14.05±3.00%、18.20±1.82%。随着吉非替尼浓度的增加,Ishikawa细胞的凋亡率逐渐增加,不同浓度组间差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。不同浓度的吉非替尼作用于Ishikawa细胞48小时后,G0/G+1期细胞比例随着药物浓度的增大而升高,与对照组相比,不同浓度组间差异明显,差异具有统计学意义(P<0.05),表明细胞周期停滞于G0/G1期。而对S期,G2//M期细胞比例无明显影响,与对照组相比,不同浓度组间差异不明显,无统计学意义(P>0.05)。4吉非替尼引起细胞周期阻滞的内在机制:应用Western blot方法检测不同浓度吉非替尼作用Ishikawa细胞48h后p-Akt、CyclinD1蛋白水平变化,结果显示:p-Akt、CyclinD1蛋白在Ishikawa细胞中均有表达。经过不同浓度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用后,Ishikawa细胞中p-Akt、CyclinD1蛋白浓度随着吉非替尼浓度的增加而逐渐下降,并呈剂量依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1吉非替尼对人子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外生长具有明显的抑制作用,具有浓度和时间依赖性。2吉非替尼能诱导体外人子宫内膜癌细胞Ishikawa的凋亡,凋亡率随着吉非替尼浓度的增加而增长,同时将细胞阻滞在G0/G1期。3吉非替尼阻滞细胞周期,诱导Ishikawa细胞凋亡,其分子机制可能与其下调p-Akt蛋白及CyclinD1蛋白的表达有关。