猕猴桃属（Actinidia Lindl.）包含54个种和21个变种,共75个分类单元。目前商业化栽培的猕猴桃有中华猕猴桃、美味猕猴桃、毛花猕猴桃和软枣猕猴桃,其中中华猕猴桃、美味猕猴桃和毛花猕猴桃在中国的栽培适宜范围为黄河以南地区,该地区冬季低温一般不超过-10°C。近年来,猕猴桃种植面积不断扩大,其种植区域呈现逐年北移的趋势,北方冬季的极端低温导致猕猴桃容易遭受冻害,轻则造成减产,重则导致整个植株的死亡。软枣猕猴桃是一个特殊的种,它的地理分布范围广泛,且具有优良的抗寒性状,分布于东北地区的软枣猕猴桃在冬季能抵御-40°C左右的极端低温。因此,探究软枣猕猴桃的抗寒机制,筛选出抗寒性关键基因并用于抗寒育种是解决猕猴桃低温冻害问题的根本方法。本研究以不同抗寒性的软枣猕猴桃为试验材料,对其进行二代转录组、三代全长转录组和代谢组分析,鉴定出响应低温胁迫的关键代谢通路、基因和代谢物,并对候选基因进行转基因功能验证,明晰软枣猕猴桃的抗寒性分子机制,主要研究结果如下:1.利用三代全长转录组测序技术解析低温条件下不同抗寒性软枣猕猴桃的转录表达谱,鉴定一系列关键候选基因。抗寒性强的‘KL’（魁绿雄）和抗寒性弱的RB休眠期枝条在-25°C下处理0 h、1 h和4 h,利用三代全长转录组测序技术共获得24,306条全长转录本,N50为1,834 bp。差异基因的KEGG富集分析表明,这些差异基因通过‘磷脂酰肌醇信号系统’、‘肌醇磷酸信号系统’、‘激素信号传导’、‘MAPK信号传导’和‘淀粉-蔗糖代谢’途径参与低温响应。在‘淀粉-蔗糖代谢’途径中,共鉴定到3个关键基因（β-GC、TPS5和BAM3.1）,它们分别参与纤维素降解、海藻糖合成和淀粉降解过程。上述3个基因分别编码β-葡萄糖苷酶（β-GC）、海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和β-淀粉酶（BAM）,它们的酶活性在低温胁迫下均被提高。此外,AP2/ERF、b HLH和MYB家族三类转录因子也参与了低温响应。加权基因共表达网络分析（WGCNA）结果显示,β-GC、TPS5和BAM3.1基因是参与‘淀粉-蔗糖代谢’途径的关键基因,它们与CBF、MYC2和MYB44基因共表达且相互调控。因此,‘淀粉-蔗糖代谢’途径在软枣猕猴桃的低温应答调控网络中起着重要的作用。2.利用代谢组结合转录组联合分析,鉴定与抗寒性相关的代谢途径和关键代谢物。通过对低温处理后的软枣猕猴桃KL和RB休眠期枝条进行代谢组分析,共鉴定到565种代谢物。通过与转录组的联合分析,我们发现两个基因型响应低温胁迫的代谢途径存在差异。其中与细胞膜完整性相关的脂质类代谢产物在KL和RB中是共同响应的,但相较于KL,其在RB中显著积累。类黄酮代谢物在KL中能够特异的积累。酚酸和核苷酸类代谢物在RB中特异的积累。因此,软枣猕猴桃在休眠期通过减少酚酸类代谢物降低能量代谢以及积累黄酮类代谢物增强抗氧化能力来提高抗寒性。3.β-淀粉酶基因Aa BAM3.1功能鉴定及转录调控解析。在中华猕猴桃全基因组水平共鉴定到16个Ac BAM基因,它们分布于中华猕猴桃的11条染色体上。在16个基因中共有5个存在复制关系,占全部基因的31.25%。此外,它们的蛋白质理化性质较为保守,拥有较高的氨基酸序列相似性。利用16个Ac BAM基因在软枣猕猴桃的全长转录组数据库中进行blast,共获得16个Aa BAM基因,结合二代转录组数据,分析了这16个Aa BAM基因在低温胁迫下的表达水平,其中Aa BAM3.1显著的受到低温诱导。将Aa BAM3.1基因在猕猴桃和拟南芥中进行超表达,低温处理后的猕猴桃和拟南芥超表达株系的抗寒性优于野生型,超表达株系的相对电导率、MDA含量、过氧化氢和超氧阴离子自由基积累都显著的低于野生型对照。而超表达株系的可溶性糖含量和BAM酶活性都是显著高于野生型对照,进一步说明Aa BAM3.1基因通过增加可溶性糖含量来减少渗透胁迫和氧化胁迫,以达到提高抗寒性的作用。启动子GUS活性和顺式元件分析结果显示Aa BAM3.1的启动子受到低温诱导且启动子上游存在CBF基因的结合位点。通过酵母单杂交、GUS共表达和双荧光素酶报告基因试验的进一步验证,证实Aa CBF4直接调控Aa BAM3.1。因此,我们认为Aa CBF-Aa BAM模块参与了猕猴桃抗寒性的正向调控。4.无色花青素还原酶基因Aa LAR的功能鉴定。低温处理后,软枣猕猴桃枝条中的原花青素含量显著增高,利用q RT-PCR检测原花青素合成途径中结构基因的表达水平,发现Aa LAR的表达水平显著上调,且KL中的表达量也显著高于RB。比较KL和RB中Aa LAR的CDS和启动子序列,结果发现Aa LAR启动子序列中存在60 bp的In Del,在抗寒性强的基因型中,启动子区域多了一个MYC-CORE（CANNTG）基序,而在抗寒性弱的基因型中此位置插入60 bp后导致MYC结合位点丢失。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因试验结果表明,Aa MYC2单独存在时并不能与Aa LAR启动子的MYC-CORE元件结合,Aa MYC2可能需要在Aa MYB的协助下才能够与Aa LAR启动子的MYC-CORE元件结合,进而促进软枣猕猴桃枝条中原花青素的积累,而积累的原花青素通过提高ROS清除能力,最终增强软枣猕猴桃的抗寒性。因此,我们推测Aa MYB-Aa MYC-Aa LAR途径参与了猕猴桃抗寒性的正向调控。本研究通过转录组和代谢组分析,系统研究了软枣猕猴桃的抗寒性分子机制,并对关键的候选基因进行了功能鉴定,初步明确了软枣猕猴桃种内抗寒性差异形成的原因,提出了Aa CBF-Aa BAM和Aa MYB-Aa MYC-Aa LAR这两条调控途径介导的软枣猕猴桃抗寒性分子模型,为软枣猕猴桃的抗寒性育种提供理论依据。