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神经系统疾病对人类健康的危害很大。中枢神经系统不同疾病的生理病理机制虽然各不相同,但近年的研究表明,脑缺血、脑出血、癫痫、脑外伤、缺氧性脑病,神经系统变性及退行性变等神经系统疾病均具有某些相似或共同的生理病理机制,均存在细胞坏死和凋亡。神经保护已成为21世纪神经病学研究的重点。
氧化应激(oxidativestress)是指机体内氧自由基的产生与消除失去平衡,或外源性的过量摄入,导致活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)在体内堆积引起细胞毒性。ROS生成增多,可触发神经细胞的兴奋性毒性和凋亡这两个导致神经元死亡的主要因素。阐明氧化应激在神经损伤以及神经退行性疾病中的作用,能为许多神经系统疾病提供新的治疗措施。
第一部分H2O2预处理的适应性神经保护作用研究
目的:探讨H2O2预处理对PC12细胞抗氧化应激损伤的适应性神经保护作用。
研究方法:
1.Hochest染色检测PC12细胞凋亡。
2.PI染色流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)检测PC12细胞凋亡。
3.MTT检测PC12细胞存活率。
研究结果:
1.H2O2损伤浓度与时间的确定:
①用100-500μmol/L的H2O2处理PC12细胞,引起PC12细胞的凋亡具有剂量依赖性的关系。②为了进一步确定300μmol/LH2O2在24h内对PC12细胞凋亡的影响,我们选取了不同时间段(4h、8h、12h、18h和24h)来观察PC12细胞的凋亡情况。
根据以上的实验结果,本文选定H2O2的损伤浓度为300μmol/L,损伤时间为12h,开展以后的研究工作。
2.H202预处理浓度、时间与间隔的确定:
①H2O2预处理浓度的确定:上述实验结果表明,H2O2对PC12细胞的损伤具有剂量-时间依赖性的特点,100μmol/LH2O2对PC12细胞几乎无损伤作用(p>0.05),所以选择100μmol/L为H2O2的预处理浓度。
②预处理时间的确定:有文献报道,几次短暂的脑缺血预处理后,最强的脑保护作用发生在间隔24h后,因此本文选择24h为预处理间隔,考查预处理的时间。结果显示,100μmol/LH2O2预处理90rmin,间隔24h,可以明显抑制由300μmol/LH2O2诱导的PC12细胞的凋亡,细胞凋亡率由(65.83±2.06)%(44.63±3.35)%(p<0.05)。而预处理30min、60min和120min组的凋亡率与损伤组相比,,没有统计学差异(p>0.05)。因此本文确定90min为预处理时间。
③预处理间隔的确定:上述结果表明,H2O2预处理90min,间隔24h组,细胞凋亡率为(44.63±3.35)%(p<0.05),可以明显对抗300μmol/LH2O2诱导的PC12细胞的凋亡,为进一步确定预处理的间隔时间,本文分别观察预处理间隔为12h和36h时,H2O2预处理抗细胞凋亡的作用。结果表明,预处理间隔12h组和36h组的细胞凋亡率,与损伤组相比,p>0.05,无统计学差异。提示:100μmol/LH2O2预处理PC12细胞90min后,间隔24h能产生明显的细胞保护作用。综合以上的实验结果,本研究以100μmol/L作为H2O2的预处理浓度,90min作为H2O2的预处理时间,24h作为H2O2的预处理间隔,开展后续的研究工作。
3.H202预处理对PC12细胞抗氧化应激损伤的适应性神经保护作用:
①经Hochest荧光染色后,在荧光显微镜下观察到,对照组PC12细胞染色质分布均匀,为弥漫均匀的低强度荧光;经300μmol/LH2O2处理12h后,未经100μmol/LH2O2预处理的PC12细胞,呈现出典型的凋亡特征,大量的细胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光;经100μmol/LH2O2预处理90min的PC12细胞,能对抗由300μmol/LH2O2引起的损伤,其中细胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞明显减少。100μmol/LH2O2预处理本身不引起细胞凋亡。
②我们通过对凋亡图谱中亚二倍体峰的定量分析发现,经300μmol/LH2O2处理12h后,未经100μmol/LH2O2预处理的PC12细胞,其凋亡率增加到(65.80±3.20)%(p<0.01);经100μmol/LH2O2预处理的PC12细胞,其凋亡率由300μmol/L组的(65.8±3.20)%降低到(44.3±3.30)%(p<0.01);100μmol/LH2O2预处理本身不引起细胞凋亡。以上结果充分表明,H2O2预处理能够对抗高浓度H2O2诱导的PC12细胞的凋亡。
③MTT细胞存活率的实验结果同样验证了以上的结论。
综合以上Hochest染色的凋亡细胞形态学的实验结果、FCM流式细胞仪定量检测凋亡细胞的实验结果以及MTT对细胞存活率的检测结果,本研究证实,100μmol/L的H2O2预处理PC12细胞90min,间隔24h,可以对抗随后给予的高浓度(300μmol/L)H2O2诱导的PC12细胞的凋亡,产生显著的适应性神经保护作用。
结论:H2O2预处理能使PC12细胞对抗氧化应激损伤,产生明显的适应性神经保护作用。
第二部分JAK/STAT信号通路在H2O2预处理的适应性神经保护中的作用研究
目的:探讨JAK/STAT途径、iNOS和COX-2在氧化应激预处理的适应性神经保护中的作用;阐明JAK/STAT途径分别与iNOS和COX-2在氧化应激预处理的适应性神经保护作用中的关系。研究方法:1.Westernblot定性定量分析各种蛋白被H2O2预处理激活的情况。
2.Hochest染色检测PC12细胞凋亡。
3.PI染色流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)检测PC12细胞凋亡。
4.MTT检测PC12细胞存活率。
研究结果:1.JAK/STAT信号通路介导了H2O2预处理的适应性神经保护作用①100μmol/LH2O2预处理PC12细胞90min后,诱导了JAK2的快速表达和酪氨酸磷酸化,但没有激活JAK1。
②JAK2活性的上调和酪氨酸磷酸化诱导了STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化以及核转移。
③在H2O2预处理前20min给予JAK2的特异性抑制剂AG-490(10μmol/L),可以完全阻断H2O2预处理对JAK/STAT通路的激活,不但阻断了JAK2的上调和酪氨酸磷酸化,而且阻断了STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化以及核转移。
④在H2O2预处理前20min给予JAK2的特异性抑制剂AG-490(10μmol/L),可以阻断H2O2预处理抗PC12细胞凋亡的细胞保护作用,使PC12细胞的凋亡率明显增加,存活率减少。
以上结果充分证实,H2O2预处理能激活JAK/STAT信号通路,表明JAK/STAT信号通路参与了H2O2预处理诱导的适应性神经保护作用。
2.JAK/STAT信号通路通过iNOS介导H2O2预处理的适应性神经保护作用:①10μmol/LH2O2预处理,可以明显上调iNOS的表达。
②在H2O2预处理前20min给予iNOS的特异性抑制剂AG(10μmol/L),不但可以阻断iNOS的表达上调,而且可以取消H2O2预处理的适应性神经保护作用,表明iNOS参与了H2O2预处理的适应性神经保护作用。
③进一步的研究表明,JAK/STAT信号通路的特异性抑制剂AG-490(10μmol/L),可以明显抑制H2O2预处理诱导的iNOS表达上调(p<0.01)。
结果表明,H2O2预处理可以激活iNOS,JAK/STAT信号通路可通过iNOS介导H2O2预处理的适应性神经保护作用。
3.JAK/STAT信号通路通过COX-2介导H2O2预处理的适应性神经保护作用:①100μmol/LH2O2预处理,可以诱导COX-2的表达显著上调。
②在预处理前20min给予COX-2的特异性抑制剂NS-398(10μmol/L),不仅可以完全阻断COX-2的表达,而且可以明显取消H2O2预处理的适应性神经保护作用。
③在预处理前20min给予JAK2的特异性抑制剂AG-490(10pmol/L),可以明显抑制由H2O2预处理诱导的COX-2的表达上调(p<0.01)。
结果表明:H2O2预处理可以激活COX-2,JAK/STAT信号通路通过COX-2介导H2O2预处理的适应性神经保护作用。
结论:
1.JAK/STAT信号通路介导了H2O2预处理的适应性神经保护作用。
2.JAK/STAT信号通路通过iNOS介导了H2O2预处理的适应性神经保护作用。
3.JAK/STAT信号通路通过COX-2介导了H2O2预处理的适应性神经保护作用。