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背景肝脏缺血再灌注(hepatic ischemia reperfusion,HIR)损伤是临床常见的病理生理过程,多见于肝脏外科相关手术(包括肝移植、肝叶切除等)及休克,腹部外伤等。目前,肝脏IR损伤后发生的肝功能障碍仍然是临床上急需解决的一个问题,如何防治这类损伤是围手术期肝保护相关领域的热点。大量研究表明TLR4炎症通路与内源性损伤相关蛋白HMGB1在肝脏缺血再灌注损伤的发生发展中占据重要地位。阿片受体激动剂的器官保护作用在心脏、神经系统中进行了深入的研究,但是有关阿片受体的肝保护作用仍鲜有报道。我们课题组前期研究已证明,阿片类药物预处理能通过NOS/NO通路有效减轻肝IR损伤。本研究旨在进一步探讨mu阿片受体的激活下调TLR4炎症相关信号通路在肝脏IR损伤中的机制。方法1.采用小鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,比较假手术组、缺血再灌注对照组、mu阿片受体激动剂预处理组、mu阿片受体激动剂对照组之间血清中转氨酶、肝脏组织结构变化的差异以及TNF-α、IL-6mRNA水平。为观察mu阿片受体在阿片类药物预处理肝保护中的作用,随机分为六组,比较假手术组、缺血再灌注对照组、mu阿片受体激动剂预处理组、mu阿片受体拮抗剂处理加激动剂预处理组、mu阿片受体拮抗剂处理组、mu阿片受体拮抗剂对照组。比较各组之间再灌注后血清中转氨酶、肝脏组织结构变化的差异以及TNF-α、IL-6mRNA水平。2.1检测Kupffer细胞相关MCP-1、MIP-2mRNA表达,免疫组织化学染色检测Kupffer细胞标志物(F4/80)表达;采用氯化钆清除小鼠肝脏Kupffer细胞,观察mu阿片受体在阿片类药物预处理肝保护中的作用,参照上述分组,比较各组之间再灌注后血清中转氨酶、肝脏组织结构变化的差异以及TNF-α、IL-6mRNA水平。2.2观察小鼠巨噬细胞系RAW264.7在缺氧复氧处理后TLR4及其下游相关信号通路p-IkB、p-NF-kB蛋白表达活化情况,以及p-NF-kB的入核现象及胞内定位。3.采用TLR4基因敲除老鼠与野生鼠对照,参照以上处理,观察缺血再灌注损伤后血清TNF-α、IL-6水平;TLR4重要内源性配体HMGB1缺血再灌注损伤后的胞内定位;HMGB1中和抗体对肝脏缺血再灌注损伤后血清TNF-α、IL-6水平的影响;分离TLR4基因敲除老鼠与野生鼠腹腔巨噬细胞(PBMC),采用siCamkⅣ转染PBMC,观察缺氧复氧处理后的HMGB1释放。结果:1.肝脏缺血再灌注后,mu阿片受体激动剂中、高剂量(RPC2、3)组缺血再灌注损伤后ALT、AST水平较IR组均显著降低;组织形态学显示肝细胞坏死及中性粒细胞浸润情况减轻。拮抗阿片受体后,NLX/RPC组缺血再灌注损伤后ALT、AST水平较mu阿片受体激动剂(RPC)组显著升高,NLX组缺血再灌注损伤后ALT、AST水平较IR组显著升高,组织形态学变化亦同上,TNF-α、IL-6mRNA水平变化同血清学变化。2.1缺血再灌注后肝脏组织中MCP-1、MIP-2mRNA水平逐渐增高,mu阿片受体激动剂预处理(RPC)组较缺血再灌注(IR)对照组下降;IR组小鼠肝脏Kupffer细胞的活化要明显高于sham组、agonist组;RPC组小鼠肝脏Kupffer细胞的活化较IR组有明显减弱。氯化钆处理后,拮抗阿片受体(GdCl3+IR)组血清ALT、AST水平较处理前(IR)组有显著下降,组织病理学变化亦同上;氯化钆处理后,(GdCl3+IR)组及其余各组肝脏组织中TNF-α、IL-6mRNA水平,较处理前(IR)组有显著下降。2.2小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞缺氧复氧处理后,TLR4蛋白表达较sham组增高;给予阿片受体激动剂预处理后,TLR4蛋白表达下降,但仍高于sham组;拮抗阿片受体后,TLR4蛋白表达再次增高;p-IkB蛋白表达较sham组增高;给予阿片受体激动剂预处理后,p-IkB蛋白表达下降,但仍高于sham组;拮抗阿片受体后,p-IkB蛋白表达再次增高;p-NF-kB蛋白表达较sham组增高;给予阿片受体激动剂预处理后,p-NF-kB蛋白表达下降,但仍高于sham组;拮抗阿片受体后,p-NF-kB蛋白表达再次增高。阿片受体与TLR4之间可能存在的某些相互作用,影响了TLR4下游NF-kB的入核。3.野生型小鼠血清TNF-α、IL-6水平与前期实验结果基本一致,然而由于TLR4缺失的小鼠炎症相关信号通路的失活,在肝脏IR损伤后,各处理组血清TNF-α、IL-6水平变化不明显;阿片激动剂预处理能够部分抑制HMGB1从核内释放出来,拮抗阿片受体能够翻转这种效应。TLR4-/-小鼠IR后HMGB1出核较少;给予HMGB1中和单抗,阿片受体的作用消失;干扰CamkⅣ与阿片受体的激活在肝IR损伤的保护作用中具有重叠效应。结论1.激活mu阿片受体可有效减轻肝脏缺血再灌注损伤,降低血清转氨酶,减轻肝脏组织病理学损伤,降低肝脏组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-6mRNA水平;拮抗阿片受体后,可以有效翻转阿片受体激动剂的保护作用。2.1在整体动物水平,通过相关标志物的检测证实Kupffer细胞的活化参与了肝脏缺血再灌注损伤。阻断Kupffer细胞后,肝损伤明显减轻,但阿片受体的肝保护作用也随即消失。2.2在离体细胞水平,通过观察TLR4相关信号通路中几个相关靶蛋白表达情况,进一步证实阿片受体的激活下调了TLR4炎症通路并抑制了p-NF-KB的入核活化。3.通过野生型、TLR4-/-小鼠在体及离体的原代腹腔巨噬细胞进一步证实阿片受体通过CamkⅣ减少HMGB1的释放,从而抑制炎症反应的瀑布级联效应。