论文部分内容阅读
[目的]研究云南白药对体外分离培养的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)成骨/成牙本质向分化过程中矿化结节形成和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、骨钙素(osteocalcin, OCN)及牙本质基质蛋白1 (dentin matrix protein 1, DMP1)表达的影响,为研究云南白药参与牙髓损伤修复机制以及云南白药应用于牙髓病临床治疗提供实验依据。[方法]采用组织块酶消化法从健康牙髓组织中培养获得原代hDPSCs,通过有限稀释法纯化细胞,采用流式细胞术检测细胞表面标记物,分别进行成骨诱导和成脂诱导,检测其干细胞特性,进行细胞鉴定。取第4代DPSCs,空白对照组加入含10%FBS的α-MEM培养液,实验组加入含6个不同浓度云南白药的α-MEM培养液,云南白药浓度分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、 20μg/ml及40μg/ml,MTT法检测6个不同浓度的云南白药对hDPSCs的增殖的影响。同时,用茜素红染色观察6个不同浓度云南白药对hDPSCs矿化诱导中矿化结节形成的影响,空白对照组加入矿化诱导液,实验组分别加入含6个不同浓度云南白药：1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml及40μg/ml的矿化诱导液,于诱导的第3d、7d分别进行茜素红染色。根据以上实验结果选择10gg/ml的云南白药浓度进行hDPSCs定向分化实验,空白对照组加入矿化诱导液,实验组加入含10μg/m云南白药的矿化诱导液,于诱导的第3d、7d、14d进行茜素红染色,观察矿化结节形成情况,并于诱导的第3d、7d、14d采用RT-PCR检测lDPSCsALP、DSPP、OCN及DMP1的表达。[结果]通过组织块酶消化法于原代培养后3-5天见细胞从组织块边缘游出,用有限稀释法获得相对纯化均一的hDPSCs；流式细胞术分析细胞表面抗原标记结果显示,CD29、CD90、CD105、CD146、STRO-1表达阳性,CD34及CD45表达阴性；成骨诱导的细胞茜素红染色镜下见矿化结节形成,成脂诱导的细胞油红O染色镜下见脂滴形成。MTT法检测云南白药对hDPSCs的增殖影响结果显示,1Oμg/ml云南白药组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；茜素红染色检测云南白药对hDPSCs矿化结节形成影响结果显示,10μg/ml云南白药组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测云南白药对hDPSCs矿化基因ALP、DSPP、OCN及DMP1表达影响结果显示,10μg/ml云南白药组ALP、DSPP、OCN及DMP1的表达量高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05).[结论]1.10μg/ml云南白药可促进hDPSCs的增殖；2. 10μg/ml云南白药可促进hDPSCs矿化结节的形成；3.10μg/ml云南白药可上调hDPSCs ALP、DSPP、OCN及DM MP1的表达。