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宫颈癌在女性恶性肿瘤中发病率居第二位,仅次于乳腺癌。全球每年新增发病人数约49.3万,死亡人数约23万,并呈逐年上升的趋势,已成为一个严重威胁人民健康和生命的问题,我国属于低发国家,但是由于人口基数大,每年的新发病例约14万。宫颈癌传统的疗法多采用常规手术切除、放疗及化疗等,但预后不佳。近年来,随着分子生物学技术的进步和人类对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入,肿瘤基因治疗取得了突飞猛进的发展,为恶性肿瘤的治疗开辟了新的途径。腺病毒载体由于宿主范围广、感染效率高、可插入外源基因片段大、病毒载体容易制备、不与宿主细胞染色体发生整合等诸多优点而受到大家的重视,成为肿瘤基因治疗中应用最为广泛的载体之一。乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种多功能糖蛋白,具有抗肿瘤作用,能明显抑制多种器官包括食道、口腔、肺、肝、结肠和膀胱等多种肿瘤发生、生长和转移。目前,关于人乳铁蛋白(Human Lactoferrin,hLF)对宫颈癌作用的研究尚未见报道,尤其对乳铁蛋白诱导癌细胞凋亡的分子机制尚不清楚。因此,本研究采用MTT、荧光染色、流式细胞术、Western blot、ELISA、免疫组化等技术,探讨了复制缺陷性腺病毒介导的人乳铁蛋白(Ad-hLF)抗宫颈癌的作用及机理,从肿瘤组织细胞周期、细胞凋亡和对机体免疫调节等方面进行了深入的研究,并获得如下研究结果。(1)重组腺病毒的扩增、纯化、鉴定和滴度测定。本试验通过对重组腺病毒Ad-hLF和空载体病毒Ad-GFP转染HEK293细胞,经扩增,纯化,滴度测定,获得了较高的滴度,分别为2.1×10~9pfu/mL和3.4×10~9pfu/mL(2) Ad-hLF对宫颈癌HeLa细胞增殖及机理的影响。本试验采用腺病毒介导的人乳铁蛋白(Ad-hLF)感染宫颈癌HeLa细胞。通过MTT、荧光染色、细胞划痕试验、细胞周期分析、RT-PCR等技术检测Ad-hLF对HeLa细胞的影响。结果发现,Ad-hLF处理可显著抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖和迁移(P<0.05);阻碍HeLa细胞细胞周期进程,使HeLa细胞发生G0/G1期阻滞; Ad-hLF可诱导HeLa细胞凋亡;Ad-hLF可诱导HeLa细胞Bcl-2 mRNA表达的下调,而上调Bax mRNA的表达,导致Bcl-2/Bax比值的下降,促进细胞凋亡。(3)Ad-hLF对荷瘤小鼠实体瘤生长及机理的研究。Ad-hLF可显著抑制U14实体瘤的生长(P<0.05),肿瘤抑制率达53.51%,并能有效延长其存活时间;流式细胞术分析发现Ad-hLF处理可使荷瘤小鼠肿瘤组织细胞中游离[Ca2+]显著升高(P<0.05),Ad-hLF处理可下调细胞周期蛋白CyclinE蛋白的表达(P<0.05),显著上调P21,P27蛋白的表达(P<0.05),致使肿瘤组织细胞阻滞于G0/G1期。而且Western blot结果表明,Ad-hLF处理可上调荷瘤小鼠肿瘤组织细胞中Fas蛋白的表达;下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达;同时活化caspase-3,通过死亡受体和线粒体途径同时诱导肿瘤组织凋亡。(4)瘤内注射Ad-hLF对荷瘤小鼠免疫调节作用的影响。Ad-hLF处理可以刺激荷瘤小鼠机体产生抗肿瘤免疫效应,提高NK细胞的活性;Ad-hLF可使荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚群的数量显著增加(P<0.05),通过对血清相关细胞因子进行测定发现,荷瘤小鼠血清IFN-γ和IL-2水平均显著升高(P<0.05),IL-4水平显著下降(P<0.05),从而逆转由于肿瘤生成而发生的Th1/Th2平衡向Th2漂移;同时,Ad-hLF处理可降低血清TNF-α水平,使肿瘤细胞失去生长和转移的必要基质条件。而且,Ad-hLF处理可抑制肿瘤血管内皮生长因子VEGF的表达。