论文部分内容阅读
海洋微生物代表了一种具有潜力的、可持续利用的天然产物资源,在产生新型次级代谢产物方面展现了巨大的潜力。海绵体内存在高丰度和多样性的共生微生物群落,是海洋微生物的主要贡献者。海绵共生微生物在宿主化学防御方面扮演着重要的角色,因此通常会产生许多结构新颖、活性较好的次级代谢产物。但是,传统培养和分离方法经常面临微生物次级代谢产物产生难、重复分离等问题,束缚了海洋微生物次级代谢产物的开发。微生物次级代谢产物诱导培养、预测与排重相结合的发掘策略将有助于解决上述难题。同时,微生物前体定向生物合成策略有助于对次级代谢产物进行结构改造,得到活性更好的“非天然”次级代谢产物。本研究首先确定了可产生功能分子的海绵共生微生物潜力菌株。OSMAC策略（One Strain Many Comounds）结合高分辨质谱排重策略揭示海绵共生真菌Acremonium persicinum F10在大米培养基中具有合成新结构次级代谢产物的潜力;表观遗传修饰剂诱导结合高分辨质谱排重策略发现,硼替佐米可诱导海绵共生真菌Pestalotiopsis maculans 16F-12产生新结构次级代谢产物;基因组挖掘结合高分辨质谱预测策略揭示海绵共生放线菌Streptomyces sp.MB044和Streptomyces rochei MB037具备产生活性次级代谢产物的潜力;此外,OSMAC策略结合高分辨质谱,预测海绵共生真菌Eurotium rubrum 13J1-4具备产生活性次级代谢产物的潜力。随后,本研究通过扩大培养、追踪分离和谱学鉴定（高分辨质谱、一维、二维核磁共振谱、红外和紫外图谱等）对潜力菌株次级代谢产物进行分析。本研究从菌株A.persicinum F10中追踪到7个新的环肽类化合物（化合物1-6和9）和2个已知化合物（化合物10和11）。利用体外螯合反应,得到2种新的螯合镓离子的化合物（化合物7和8）;从菌株P.maculans 16F-12次级代谢产物的差异峰中追踪到6个单体化合物,鉴定为4个新的Bergamotene倍半萜类化合物（13-16）和2个已知化合物（17-18）;从海绵共生真菌E.rubrum 13J1-4、放线菌Streptomyces sp.MB044和S.rochei MB037中得到8个已知化合物（18-25）。新化合物1、5、7和8对临床最常见的侵袭性致病真菌烟曲霉具有较好的抑制活性,活性与阳性对照两性霉素B相当（MIC为1.0μM）;化合物Borrelidin（25）展示了较强的抑制肿瘤细胞的活性,对肺癌细胞株A549、H446和H1688的细胞毒活性均在亚微摩尔水平,IC50值分别为0.4μM、0.3μM和0.3μM。Borrelidin因对正常细胞毒性较强而导致其治疗指数（Therapeutic index,TI）偏低,阻碍了临床应用。我们通过Borrelidin产生菌株S.rochei MB037的前体定向生物合成,建立了一种高效合成低毒性抗血管生成化合物BC194的技术。本研究确定了Radix astragali（RA）培养基为菌株S.rochei MB037产生Borrelidin的最佳培养基,通过添加5 m M外源前体反式-1,2-环丁烷二羧酸实现了BC194的定向生物合成。我们分析Borrelidin内源前体反式-1,2-环戊烷二羧酸的生合成途径发现,3,4-二羟基苯乙酸-2,3-双加氧酶（DHPAO）是该途径的关键酶。通过筛选酶抑制剂和底物类似物,发现铁氰化钾是该酶可能的抑制剂,具有抑制反式-1,2-环戊烷二羧酸产生的作用;在前体定向生物合成BC194时,添加5 m M铁氰化钾可以显著降低原产物Borrelidin的产量,同时使BC194的产量提高112.5%;通过增加外源前体反式-1,2-环丁烷二羧酸的浓度和使用大孔树脂DA-201,使菌株S.rochei MB037定向生物合成BC194的产量分别提高了69.7%和36.6%,最终产量提高至27.59±1.15 mg/L;建立了高速逆流色谱高效分离纯化BC194的方法,回收率由之前报道的56%达到93%。综上所述,本研究将微生物次级代谢产物的诱导策略、预测与排重策略相结合,快速发掘到可产生功能分子的海绵共生微生物潜力菌株。随后,从潜力菌株中追踪制备了25个化合物,包括13个新结构化合物（1-9和12-15）和高细胞毒性化合物Borrelidin。随后,利用海绵共生放线菌S.rochei MB037,进行Borrelidin的定向生物合成和产量优化研究,高效产生低毒抗血管生成化合物BC194。本研究揭示了综合发掘策略在发现与改造海绵微生物次级代谢产物中的应用潜力,为海绵共生微生物次级代谢产物的开发利用提供了借鉴。