目的:犬常被用于研究各种心律失常（房颤）及其机制。本研究以杂种犬为研究对象，旨在探讨犬心肌细胞Kv1.5通道的特性，为房颤机制研究提供理论依据。本研究课题包括:(1)快速心房起搏建立房颤犬模型;(2)探讨一种改良的两步酶分离法分离犬心房肌细胞，并适用于膜片钳实验。(3)通过全细胞膜片钳实验，观察幼年犬心房、心室肌细胞Kv1.5通道电流的差异;成年犬心房肌细胞SR组与AF组Kv1.5通道电流的差异;犬心房肌细胞Kv1.5通道电流的增龄性变化。(4)通过分子生物学实验，检测幼年犬心房、心室肌组织Kv1.5通道蛋白及基因水平的差异;成年犬心房、心室肌组织SR组与AF组Kv1.5通道蛋白水平的差异;犬心房、心室肌组织Kv1.5通道蛋白的增龄性变化。　　方法:(1)快速心房起搏建立房颤犬模型，选取健康成年杂种犬12只，体重10.0±2.0 kg，年龄24.0±0.5月，于动物手术室无菌环境下开胸，暴露左心耳，将起搏电极缝于左心耳，另外一端的心脏起搏器安置于皮下囊袋中，连接起搏器并调试起搏器参数，起搏频率为400次/分，脉冲宽度为0.1 ms，脉冲幅度为6V，待起搏器正常工作后关闭起搏器，逐层缝合关胸。术后1周，连接起搏器，连续刺激4周后监测犬ECG。(2)改良的两步酶分离法:犬称重麻醉后获取心肌组织，置于100％氧饱和的冰冷Cradiplegic液中，用眼科剪剪成小块组织(约1 mm3)，置于含酶Ⅰ（含(ⅩⅩⅣ)型蛋白酶、Ⅴ型胶原酶和白蛋白）的小瓶中消化，在消化20 min后于显微镜下发现单个犬心肌细胞即可终止消化，将组织转入酶Ⅱ（含Ⅴ型胶原酶和白蛋白）中继续消化，消化5 min后于显微镜下观察，找到3～5个杆状细胞且细胞膜完整光滑，折光性好时，可终止消化并收集细胞悬液。酶液消化过程在37℃水浴箱中进行，并需持续充氧。(3)全细胞膜片钳实验:倒置相差显微镜下选择细胞膜边缘光滑，立体感和折光性强，横纹清晰可见，具活性的心肌细胞进行电生理记录。记录Kv1.5通道电流的记录方案为:维持电压-80 mV，给予-40 mV的预刺激，指令电压从-40 mV去极化至+60 mV，持续200 ms，阶跃电压为10 mV，然后又回到-80 mV，可记录到一外向混合电流，向浴液中加入0.1mM4-AP，再次记录外向混合电流，在相同的指令电压下，加入0.1 mM4-AP前后记录到的混合电流相减得到一快速激活、缓慢失活的IKur。用以观察幼年犬心房、心室肌细胞Kv1.5通道电流的差异和成年犬心房肌细胞SR组与AF组Kv1.5通道电流的差异以及犬心房肌细胞Kv1.5通道电流的增龄性变化。(4)分子生物学实验:1）Western blotting实验，使用试剂盒提取心肌组织总蛋白并采用BCA法测定样品蛋白的含量;取组织总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜上，抗体孵育，采用Bio-Rad凝胶成像处理系统和Quantity One软件检测成像并分析处理所得图像，以GAPDH为内参照，检测幼年犬心房、心室肌组织Kv1.5通道蛋白水平的差异和成年犬心房、心室肌组织SR组与AF组Kv1.5通道蛋白水平的差异以及犬心房、心室肌组织Kv1.5通道蛋白的增龄性变化。2）RT-PCR实验，使用Trizol试剂盒提取犬心肌组织总RNA，并检测犬心肌组织总RNA的纯度及浓度;按照Takara逆转录试剂盒将已提取的总RNA逆转录成cDNA，采用SYBR GreenⅠ法实时荧光定量PCR，检测幼年犬心房、心室肌组织 KCNA5 mRNA水平的差异。　　结果:(1)起搏犬连续起搏4周后，检测ECG显示:心律绝对不齐，P波消失，代之以大小不等的f波，持续30 min以上，提示快速心房起搏房颤犬模型建立成功。(2)分离出的心肌细胞约有一半具有以下特性:横纹清晰可见、膜边缘光滑，立体感和折光性强，细胞无自主性收缩，并记录到典型的IKur和INa。(3)全细胞膜片钳实验:1）观察到犬心肌细胞IKur具有外向整流特性且能被0.1 mM4-AP阻断。2）在-40 mV～+60 mV钳制电压下，与幼年犬心房肌细胞相比，犬心室肌细胞IKur电流密度较小，但两者比较差异无统计学意义(n=5，P＞0.05)。3)与SR组成年犬心房肌细胞相比，AF组IKur电流密度下调，钳制电压为+30 mV～+60 mV时，两组比较差异有统计学意义(n=5，P＜0.05)。4)在+30 mV～+60 mV钳制电压下，与幼年组相比，成年组IKur电流密度增强，两者比较差异有统计学意义（n=5，P＜0.05）。(4) Western blotting实验:1）Kv1.5通道蛋白在幼年犬心房组和心室组均有表达，心房组表达较丰富，但两组之间的表达量无统计学差异（n=8，P＞0.05）。分别比较幼年犬左、右心房，左、右心室Kv1.5通道蛋白的相对表达，结果显示两组的Kv1.5通道蛋白表达量均无统计学差异（n=8，P＞0.05）。2）与SR组比较，AF组成年犬心房、心室肌组织Kv1.5通道蛋白表达均下调，结果显示差异有统计学意义（n=8，P＜0.05）。3）与幼年组相比，成年组心房、心室肌组织Kv1.5通道蛋白表达水平均增加，两者比较差异有统计学意义(n=5，P＜0.05)。(5) RT-PCR实验:KCNA5 mRNA在幼年犬心房、心室肌组织均表达，心房表达较丰富，但两组之间的表达量差异无统计学意义(n=8，P＞0.05)。分别比较幼年犬左、右心房，左、右心室的KCNA5 mRNA的相对表达，两组的表达量差异均无统计学意义（n=8，P＞0.05）。　　结论:(1)快速心房起搏建立房颤犬模型，是研究房颤发生、维持机制和寻找新的治疗方法的重要工具。(2)改良的两步酶分离法分离的犬心肌细胞数量多，且具有正常的电生理特性，适用于心肌细胞电生理研究。(3)幼年犬心房、心室肌均检测到Kv1.5通道电流、蛋白及基因的表达，且心房肌中表达较丰富。(4) AF时，成年犬心房肌细胞Kv1.5通道电流降低，犬心房、心室肌组织Kv1.5通道蛋白表达下调。(5)犬心肌细胞Kv1.5通道具有增龄性变化。