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目的:二噁英类化学物质是多氯代二苯并二噁英(PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(PCDFs)和共面多氯联苯(PCBs)的总称,其中以2, 3, 7, 8-四氯代二苯并-对-二噁英(2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)毒性最强。由于TCDD结构稳定,通过食物链进入人体后,在动物和人的脂肪中蓄积,对人体健康构成严重威胁,因而被世界卫生组织(World Health Organization, WHO)作为新的环境污染物列入全球环境监测计划食品部分的监测对象名单。由于有关哺乳期暴露于TCDD对子代影响的研究还不多见,所以本研究在雌性小鼠分娩后立即经腹腔注射低剂量TCDD,通过乳汁对仔鼠染毒,然后观察哺乳期暴露于TCDD对仔鼠体重增长、胸腺和脾脏发育的影响,胸腺和脾脏组织结构以及细胞色素P450 1A1酶(cytochrome P450 1A1, CYP1A1)、凋亡基因Bcl-2(B-Cell lymphoma/leukemia 2)和Bax(Bcl-associated x protein)蛋白表达的变化,为低剂量TCDD造成的子代慢性免疫器官危害及其机制提供科学依据。方法:1实验动物4月龄健康成年昆明小鼠,雌鼠24只,雄鼠8只,按照3:1的雌雄比例同笼受孕。分娩7~10只仔鼠的整窝保留,调整每窝仔鼠为8只,雌雄对半,其余淘汰。2试剂TCDD浓度为10μg/ml(TCDD/甲苯),纯度为99%,腹腔注射前将该试剂用花生油稀释,体积比为TCDD:花生油=1:4,则浓度稀释为2μg/ml。溶剂对照为甲苯和花生油按1:4体积比混合的混合液。3分组将母鼠和仔鼠作为整体(窝)进行完全随机分为5组(每组3窝):40μg和20μg TCDD/kg体重组,40μg和20μg溶剂/kg体重对照组,1个不做任何处理的空白对照组。5个实验组以下简写为40μg TCDD组、20μg TCDD组、40μg溶剂对照组、20μg溶剂对照组和空白对照组。雌鼠分娩后,立即称重并腹腔注射。经母鼠哺乳染毒至仔鼠出生后第21天,随后仔鼠自由进食。仔鼠出生后第35天被处死。4仔鼠体重的测定5仔鼠免疫器官发育指标(胸腺重量、胸腺指数、脾脏重量、脾脏指数)的测定6仔鼠胸腺和脾脏组织CYP1A1蛋白定位和半定量分析7仔鼠胸腺和脾脏组织细胞凋亡的测定7.1采用H.E染色法观察仔鼠胸腺和脾脏组织的结构变化。7.2采用免疫组织化学染色法对仔鼠胸腺和脾脏组织Bcl-2和Bax凋亡蛋白进行定位和半定量分析。结果:1 TCDD对仔鼠体重的影响新生仔鼠体重无显著性差异(P>0.05);出生后第7天开始,20μg TCDD组仔鼠的平均体重低于其溶剂对照组和空白对照组(P<0.05);随着TCDD的摄入和蓄积,40μg和20μg TCDD组仔鼠的平均体重均低于相应的溶剂对照组和空白对照组(P<0.05),并且40μg TCDD组仔鼠的平均体重低于20μg TCDD组(P<0.05);停止染毒后(出生后第28天和第35天),暴露于TCDD仔鼠的平均体重依然低于相应的溶剂对照组和空白对照组(P<0.05)。2 TCDD对仔鼠免疫器官重量的影响2.1 TCDD对仔鼠胸腺重量的影响雄性和雌性仔鼠的40μg和20μg TCDD组胸腺重量与相应的对照组之间均不具有显著性差异;雄性40μg和20μg TCDD组胸腺指数分别高于相应的溶剂对照组(P<0.05),雌性之间无统计学差异。2.2 TCDD对仔鼠脾脏重量的影响雄性和雌性仔鼠的40μg和20μg TCDD组的脾脏重量与相应的溶剂对照组之间均无显著性差异;雄性40μg TCDD组脾脏指数高于20μg TCDD组和相应对照组(P<0.05),雌性之间无统计学差异。以上结果提示哺乳期暴露于TCDD可以导致雄性仔鼠免疫器官指数升高,而雌性仔鼠无明显变化。3 TCDD对仔鼠胸腺和脾脏组织CYP1A1蛋白表达的影响CYP1A1蛋白主要表达于仔鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的线粒体和内质网中。哺乳期低剂量暴露于TCDD,无论雌性和雄性仔鼠,其40μg和20μg TCDD组胸腺和脾脏组织淋巴细胞CYP1A1蛋白的表达均增高(P<0.05),并且各组雌性仔鼠的CYP1A1蛋白表达高于雄性仔鼠(P<0.05)。4 TCDD对仔鼠胸腺和脾脏组织细胞凋亡的影响哺乳期低剂量暴露于TCDD,仔鼠40μg和20μg TCDD组胸腺和脾脏组织淋巴细胞排列紊乱,胞体皱缩,核染色质浓集,呈现细胞凋亡现象。凋亡基因Bcl-2和Bax主要表达于仔鼠胸腺和脾脏淋巴细胞胞浆中。哺乳期低剂量暴露于TCDD可使雌性和雄性仔鼠的胸腺和脾脏细胞Bcl-2蛋白的表达减低(P<0.05),但雌性仔鼠Bcl-2蛋白表达始终高于雄性(P<0.05)。凋亡基因Bax主要表达于仔鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的胞浆和胞核中。哺乳期低剂量暴露于TCDD使雌性和雄性仔鼠胸腺和脾脏淋巴细胞Bax蛋白的表达均明显增高(P<0.05),并且雌性仔鼠增高较雄性明显,存在性别差异(P<0.05)。哺乳期低剂量暴露于TCDD使雌性和雄性仔鼠40μg和20μg TCDD组胸腺和脾脏淋巴细胞Bcl-2/Bax比值均降低(P<0.05),说明TCDD可以诱导仔鼠胸腺和脾脏组织淋巴细胞凋亡。结论:1哺乳期低剂量暴露于TCDD,可以阻碍仔鼠的体重增长,并且这种阻碍作用并不随着染毒的停止而停止,具有持续性。2哺乳期低剂量暴露于TCDD,可以使雄性仔鼠的胸腺指数和脾脏指数显著增高,对雌性仔鼠没有影响。TCDD对子代小鼠的免疫毒性作用是否存在性别差异还需进一步研究证实。3哺乳期低剂量暴露于TCDD,可以使仔鼠胸腺和脾脏组织CPY1A1蛋白表达增加,同时雌性CYP1A1蛋白表达高于雄性,TCDD对仔鼠免疫器官的影响存在性别差异。4哺乳期低剂量暴露于TCDD,可以诱导胸腺和脾脏淋巴细胞呈现凋亡改变,使Bcl-2蛋白表达减低,Bax蛋白表达增高,Bcl-2/Bax比值降低。Bcl-2凋亡基因家族比值的改变可能是TCDD导致细胞异常凋亡的重要机制之一,也可能是TCDD导致免疫功能抑制的原因之一。并且Bcl-2和Bax蛋白表达的雌雄差异,可能是雌雄仔鼠对TCDD敏感度不同、损害程度不同的原因之一。