第一部分mTORC1通过β-catenin信号通路调节RANKL/OPG和破骨细胞形成一、研究背景骨的代谢是一个动态过程,并随着机械应力、激素及细胞因子等的改变而维持动态的重建,包括骨形成与骨吸收,如此骨组织才具有正常的形态,发挥应有的功能。在骨代谢中骨细胞的主要作用是接收并传递信号给周围的成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC),从而启动骨重建。OC主要负责吸收局部骨组织,于此同时OB则形成新骨以替代被吸收的骨组织。OC是由骨髓造血干细胞中的单核/巨噬细胞系分化而成的多核细胞,其活性受多种细胞因子和激素的调节,但具体的机制不清楚。骨保护素(osteoprotegerin, OPG)、核因子KB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor—kappaB, RANK)及核因子KB受体活化因子配体(receptoractivator of nuclear factor—kappa B ligand, RANKL)系统是自1997年以来发现的一组调控破骨细胞分化激活的细胞因子,三者均属肿瘤坏死因子受体超家族(tumomecrosis factor receptor superfamily, TNFRSF)。成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL,与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后,通过激活调节破骨细胞形成的转录因子,从而促进破骨细胞的形成和分化,并抑制破骨细胞的凋亡。由成骨细胞分泌的OPG可以与RANKL结合,竞争性抑制RANKL与RANK之间的结合,从而抑制破骨细胞的增殖和分化,并最终抑制骨吸收。越来越多的证据证明许多激素、细胞因子直接或间接地调节RANK/RANKL/OPG系统,从而介导破骨细胞的分化和功能,导致多种骨代谢疾病,包括骨质疏松、糖皮质激素导致的骨丢失、多发性骨髓瘤以及风湿性关节炎等。另外,靶向OPG/RANK/RANKL系统的药物比如外源性的OPG、抗RANKL抗体、RANK—Fc等被证实是有效预防和治疗包括骨质疏松、骨肿瘤的骨溶解疾病。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target Of Rapamycin, mTOR)是一种保守的丝/苏氨酸蛋白质激酶。在细胞多种生理活动的调控中处于核心地位,接受并整合细胞内外的各种刺激如激素、生长因子、营养、能量、氧气、应激等调控着包括基因转录、蛋白质起始翻译、核糖体生物合成、自噬等过程。人类重大疾病如癌症、心血管疾病、移植排斥及自体免疫紊乱、糖尿病、肥胖、神经系统疾病等均涉及mTOR信号的失调,mTOR信号通路成为近年基础与临床研究的热点。近年来越来越多的文章报导mTOR信号通路参与骨代谢的调节。mTOR/S6K1通过调节il-6和VEGF的合成,进而调节骨形成。也有文章报导,雷帕霉素(rapamycin)增加成骨样细胞的OPN和OCN的mRNA的表达,通过抑制mTOR活性并激活bmp/smad通路促进人胚胎干细胞的成骨分化。另外,BEZ235作为PI3K和mTOR通路的抑制剂能够促进HMSCS向成骨细胞分化。尽管雷帕霉素对成骨细胞分化的影响仍然存在争论,但目前普遍认为抑制mTORC1信号通路可以促进成骨细胞分化。另外,mTOR的激活是破骨细胞前体以及成熟破骨细胞存活所必需的,有文章指出促红细胞生成素(EPO)能激活mTOR的活性,并分别通过上调NFATcl和下调组织蛋白酶K,增加破骨细胞的数量和降低破骨细胞的活性,而Rapa能够抑制EPO的作用。尽管mTOR在骨代谢中的作用被肯定,但是其具体的机制仍然不明了。最近发现转录因子CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPβ)在骨代谢中发挥重要作用。结合转基因小鼠、细胞生物学和药理学方面的研究,发现它不仅可以调控成骨细胞的活性,也可以调节破骨细胞的分化和活性。鉴于RANK/RANKL/OPG系统在骨代谢中的重要作用,特别是对破骨细胞的调控,我们猜想1mTOR是否能通过C/EBPβ调控成骨细胞及其前体释放RANKL/OPG,从而调节破骨细胞的分化和功能。目前,mTOR信号通路对RANKL/OPG的调控仍然存在较大争议,对其中的机制研究尚未见报道。二、研究结果1. mTORC1参与去卵巢诱导的破骨细胞形成和骨吸收过程雌鼠去卵巢可以降低雌激素水平,诱导骨质疏松。首先,将8-12周龄的C57B6小鼠共24只,随机分四组,分别为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)、假手术+雷帕霉素组、去卵巢+雷帕霉素组。小鼠引颈处死后取材,micro-CT检测分析、骨组织形态计量学分析、骨钙素免疫组化和破骨细胞染色检测表明：在去卵巢组小鼠中,破骨细胞活性增强,骨吸收增加；单纯灌胃雷帕霉素组小鼠破骨细胞活性受抑制,骨吸收减少；此外,雷帕霉素可以逆转去卵巢引起的小鼠骨质疏松。碱性磷酸酶(ALP)和酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)分别是成骨细胞分化和破骨细胞分化的特征性外酶,取四组小鼠的血清进行生物化学检测,结果表明抑制mTORC1会增加ALP/TRAP的比例(数据未给出)。我们进一步检测mTORC1在以上样品中的活性,发现在雷帕霉素组和雷帕霉素+去卵巢组的小鼠标本中,骨吸收的增加都伴随着mTORC1的下游信号分子S6的磷酸化活性降低,说明抑制mTORC1能降低破骨细胞的活性,促进骨吸收过程。2. mTORCl活性增加下调RANKL的表达为了进一步验证mTORC1对RANKL表达水平的调节,我们通过体外培养小鼠骨髓基质细胞系OP9、大鼠原代骨髓间充质干细胞BMSC,用mTORC1抑制剂雷帕霉素处理细胞,分别在mRNA水平和蛋白水平检测RANKL的表达,结果表明抑制mTORC1会导致RANKL表达水平的显著下调(P=0.000)。mTORC1的上游抑制基因——结节性硬化症复合物(tuberous sclerosis complex, TSC)由TSC1和TSC2组成,它们二者任一缺失都会导致mTORC1的过度活化,为了进一步验证mTORC1对RANKL的调控作用,我们体外培养TSC2未敲除和TSC2敲除的小鼠胚胎成纤维细胞系MEFTSC2+/+和MEFTSC2-/-,分别在mRNA水平和蛋白水平检测RANKL的表达,发现1mTORC1过度活化可以显著增加RANKL的表达水平(P=0.000)。为了进一步验证以上结果,我们同时用TSC2的siRNA体外敲除OP9细胞系的TSC1(P=0.024)。以上结果均确定,mTORC1对RANKL的调控作用。3. mTORC1活性增加上调OPG的表达破骨细胞形成和骨吸收过程受RANKL/OPG系统的调控,除了检测RANKL水平受mTORC1调节的现象,我们同时在体外培养的上述细胞系中分别检测了OPG的mRNA表达水平和蛋白表达水平,结果表明mTORC1活性被雷帕霉素抑制后会导致OPG表达水平的上调(P=0.004,P=0.000),在MEFTSC2+/+和MEFTSC2-/-细胞系和TSC2siRNA干扰实验中均证明OPG的表达受mTORC1负调节(P=0.000,P=0.000)。以上数据均通过统计学检验方法检验,并具有显著性差异。4. mTORC1调节RANKL/OPG的转录活性由于mTORC1活性调节了RANKL/OPG的表达水平,我们通过荧光素酶报告系统来进一步验证mTORC1是否调节了RANKL/OPG的转录活性。我们通过体外转染含有荧光素酶报告基因的质粒给OP9细胞,并用mTORC1抑制剂雷帕霉素处理,通过荧光素酶报告基因检测仪检测和分析证实：抑制mTORC1活性会显著抑制RANKL的转录活性(P=0.000),和增强OPG的转录活性(P=0.011)。以上数据均通过统计学检验方法检验,并具有显著性差异。5. mTORCl通过抑制Akt降低β-catenin的mRNA的稳定性在上述结果中,我们证实TSC缺失导致的mTORC1过度活化可以引起RANKL/OPG的比例降低,从而抑制骨吸收。在前期实验中,我们用雷帕霉素体外处理OP9细胞系,通过mRNA芯片筛选出其中表达差异显著的转录因子之一：C/EBPp (p-catenin),介于目前已报导的β-catenin对RANKL/OPG和骨代谢的调节作用,我们推测mTORC1通过对mTORC1/2负反馈途径的下游分子Akt磷酸化的调节来调控β-catenin,进而调节RANKL/OPG的比例。我们通过体外培养大鼠骨髓间充质干细胞BMSC、小鼠骨髓基质细胞系OP9,用雷帕霉素处理细胞和敲除细胞的TSC基因,得到mRNA水平和蛋白水平检测结果符合我们的预期：抑制mTORC1活性,会引起β-catenin的表达上调(P=0.000),同时伴随1mTORC2下游信号分子Akt的Ser473位点磷酸化的活性增强。为了进一步验证,我们通过用显著性抑制性Akt的腺病毒(Dominant negative Akt Ad virus)感染骨髓间充质干细胞,并用雷帕霉素处理细胞,结果证实：当Akt被抑制时,能完全抵抗mTORC1活性受阻所引起的β-catenin的表达。这说明,1mTORC1很可能是通过Akt来维持β-catenin的表达稳定性的。以上数据均通过统计学检验方法检验,并具有显著性差异。6. mTORC1通过β-catenin信号通路调节RANKL/OPG根据1mTORC1对RANKL/OPG的调节作用和β-catenin对骨代谢的调控作用,我们通过体外实验对以上分子机制进行探讨,当抑制β-catenin信号时,mTORC1对RANKL/OPG的影响,从而验证mTORC1能通过β-catenin来调节RANKL/OPG.我们对体外培养的细胞用同种属的β-catenin的siRNA干扰实验来敲除β-catenin的表达,同时用雷帕霉素处理细胞,所得结果证明：当β-catenin被抑制时,mTORC1失去了对RANKL/OPG的调控作用。三、结论综上所述,我们的研究揭示了一条新的涉及mTORC1、p-catenin、Akt与RANKL/OPG系统对骨代谢调节的信号转导通路。通过这条通路,mTORC1被抑制,进而通过mTORC1/2负反馈抑制途径激活Akt (Ser473)的磷酸化,激活的磷酸化Akt通过减少β-catenin的降解来改变RANKL/OPG的比例,进而调控破骨细胞的发生和骨吸收过程。mTORC1-Akt-β-catenin-RANKL/OPG途径对骨代谢的调控作用为雷帕霉素治疗骨质疏松病人的分子机制增添了新的内容。目前,我们通过可诱导的全身性敲除TSC1/Raptor和成骨细胞特异性敲除TSC1/Raptor的转基因小鼠,对于mTOR成为治疗骨质疏松的靶点及其治疗效果进行进一步的研究。第二部分去甲二氢化愈创木酸(NDGA)以mTORC1为靶点抑制乳腺癌的生长一、研究背景去甲二氢化愈创木酸Nordihydroguaiaretic acid (NDGA)是一种来源于石炭酸灌木Larrea divaricatta的天然的酚类化合物,目前文献报道它在体外和体内均具有抗肿瘤活性。据许多临床研究报道得知,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)的许多化学同型物正被开发为难治性实体瘤的临床药物。虽然NDGA(去甲二氢化愈创木酸)具有很好的临床药用价值,但其发挥抗肿瘤作用的分子机制目前仍然没有得到清晰的解释,这对其能得到广泛应用是一个极大的限制。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target Of Rapamycin, mTOR)是一种保守的丝／苏氨酸蛋白质激酶。在细胞多种生理活动的调控中处于核心地位,接受并整合细胞内外的各种刺激如激素、生长因子、营养、能量、氧气、应激等调控着包括基因转录、蛋白质起始翻译、核糖体生物合成、自噬等过程。人类重大疾病如癌症、心血管疾病、移植排斥及自体免疫紊乱、糖尿病、肥胖、神经系统疾病等均涉及mTOR信号的失调,mTOR信号通路成为近年基础与临床研究的热点。在本实验室前期的研究成果中发现,不饱和脂肪酸花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)及其代谢产物能以mTORC1为靶点促进乳腺癌的发生发展,而花生四烯酸的代谢途径之一脂氧合酶途径在其中发挥了重要作用,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)做为一种强抗氧化剂是抑制脂氧合酶途径的重要物质。我们推测mTORC1能作为NDGA(去甲二氢化愈创木酸)具有抗肿瘤和抑制乳腺癌生长作用的分子机制的潜在靶点。在我们的研究中,我们发现并证明了哺乳动物雷帕霉素靶标复合物1(mTORC1)是NDGA(去甲二氢化愈创木酸)的一个靶点,这个结论在体外培养的乳腺癌细胞和体内移植瘤小鼠身上都得到了验证。二、研究结果1. NDGA(去甲二氢化愈创木酸)在乳腺癌细胞中抑制mTORC1而不是mTORC2我们体外培养三种乳腺癌细胞系,在不同时间点(时间梯度)给细胞加入同一浓度的NDGA(去甲二氢化愈创木酸)和在同一时间点给细胞加入不同浓度(浓度梯度)的NDGA(去甲二氢化愈创木酸),药物处理完成后,我们通过用免疫印迹(western blot)检测mTORC1和mTORC2下游途径信号分子的表达水平和活化水平来验证NDGA(去甲二氢化愈创木酸)的作用。我们发现NDGA(去甲二氢化愈创木酸)能抑制mTORC1的活性而不是mTORC2的活性,并具有一定的时间梯度和浓度梯度。说明NDGA(去甲二氢化愈创木酸)能特异性地以mTORC1而不是mTORC2为靶点而发挥作用。2. NDGA(去甲二氢化愈创木酸)抑制mTORCl下游信号分子和抑制乳腺癌细胞的增殖细胞周期蛋白D1(cyclinD1),缺氧诱导因子(HIF-α),血管内皮生长因子(VEGF)都是mTORC1下游重要的信号分子,它们的表达水平直接受到mTORCl活性的调节并与由于mTORC1过度活化导致的肿瘤发生发展具有重要关系。我们在体外培养的乳腺癌细胞中证明,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)能抑制以上信号分子的表达水平,并在体外培养的条件下,抑制不同的乳腺癌细胞系的增殖水平(P=0.000)。以上数据同样提示了mTORC1作为NDGA(去甲二氢化愈创木酸)的靶标,对于乳腺癌的治疗具有重要意义。3. NDGA(去甲二氢化愈创木酸)抑制mTORC1通过部分活化AMPK/TSC2AMP激活蛋白激酶(AMPK)和结节性硬化症复合物2(TSC2)都是mTORC1上游的抑制基因。能量缺乏和其它多种信号刺激或药物都能引起AMPK的磷酸化从而抑制mTORC1活性；活化的AMPK能直接磷酸化TSC2并抑制mTORC1活性。为了探讨NDGA(去甲二氢化愈创木酸)作用mTORC1的分子机制,我们在体外敲除乳腺癌细胞的AMPK或TSC2发现,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)能部分通过AMPK或TSC2途径来抑制：mTORC1的活性。4. NDGA(去甲二氢化愈创木酸)抑制氨基酸和胰岛素引起的mTORC1活化,并破坏mTOR-Raptor相互作用胰岛素对mTORC1信号通路的激活是依赖于TSC途径的,而氨基酸对mTORC1信号通路的激活是不依赖于TSC2的。有趣的是,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)不但能抑制氨基酸引起的mTORC1活化,它同样能抑制胰岛素引起的mTORC1活性升高。因此,我们对NDGA(去甲二氢化愈创木酸)是否能直接作用mTORC1复合物本身进行验证。(Rapamycin)一样干扰mTOR-Raptor直接的相互作用并能抑制mTORC1的体外激酶活性。这个结果让我们明确,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)抗肿瘤的分子机制,可能是直接以mTORC1为靶标来发挥作用的。5. NDGA(去甲二氢化愈创木酸)以mTORCl为靶点抑制乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长体外水平的实验结果给了我们很好的提示,因此我们建立了乳腺癌体外移植瘤动物模型来验证NDGA能否以mTORC1为靶点,并抑制乳腺癌的生长。我们用NDGA(去甲二氢化愈创木酸)腹腔注射体外移植乳腺癌细胞的裸鼠,给药期间测量肿瘤大小,给药一个月后取材,测量,称重,鉴定。结果证明,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)在体内水平能有效抑制乳腺癌的生长,并显著下调mTORC1信号通路的下游信号分子的活性。以上数据均通过统计学检验方法检验,并具有显著性差异,P=0.000。三、结论综上所述,清楚NDGA(去甲二氢化愈创木酸)抑制肿瘤发生发展过程的分子机制对临床应用具有重要的意义。我们的研究揭示了一条新的NDGA(去甲二氢化愈创木酸)以(?)mTORC1而不是mTORC2为靶标的治疗乳腺癌发展的信号转导通路。通过这条通路,NDGA(去甲二氢化愈创木酸)能抑制mTORC1活性和乳腺癌细胞的增殖；能部分通过AMPK/TSC2发挥抑制作用；NDGA(去甲二氢化愈创木酸)能打破mTOR和Raptor的相互作用并抑制(?)mTORC1的体外激酶反应；NDGA(去甲二氢化愈创木酸)能以mTORC1为靶点并显著抑制乳腺癌体外移植瘤小鼠的乳腺癌的发展。这为NDGA(去甲二氢化愈创木酸)治疗乳腺癌,发挥抗肿瘤作用的分子机制增添了新的内容。