血管扩张刺激磷蛋白(Vasodilator stimulated phosphoprotein,VASP)是一种细胞骨架相关蛋白,属Ena/VASP蛋白家族,最初从血小板中得到分离,是蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶G(PKG)和蛋白激酶C(PKC)的作用底物。VASP整个蛋白序列由380个氨基酸组成,其中含有三个磷酸化位点,两个为丝氨酸位点(Ser157、Ser239),一个为苏氨酸位点(Thr278),这三个位点的磷酸化直接受PKG、PKA的调控。VASP的磷酸化和它的功能有着密切的关系,而且不同位点的磷酸化可使VASP呈现不同的作用。在细胞内,它主要存在于应激纤维、粘附斑(focal adhension)处应激纤维的末端、细胞间连接及细胞膜上具高动态性变化的区域。VASP在与细胞骨架调节有关的各种细胞行为中起着重要作用,与癌细胞的侵袭和转移也有着密切的关系。目前已知的VASP的功能都与它同细胞微丝结构的结合有关。　　 本研究目的:一方面,明确VASP是否为一个新的微管相关蛋白,探讨磷酸化对其与微管蛋白结合的影响；另一方面,观察磷酸化VASP在HeLa细胞内的定位,明确其在细胞周期中的作用,并且初步探讨VASP参与细胞周期调控的机制。　　 研究方法如下:　　 (1)通过免疫荧光方法,观察磷酸化VASP在HeLa细胞内的定位。　　 (2)通过免疫共沉淀、微管沉淀和Western blot方法,观察VASP及其磷酸化与α-微管蛋白的结合情况。　　 (3)用Western Blot方法观察CPT-cAMP、H89、CPT-cGMP和KT5823引起的p-VASP在HeLa细胞内分布的变化,以及H89对由CPT-cAMP和KT5823对由CPT-cGMP引起的p-VASP细胞分布变化的影响。　　 (4)通过胸苷(TDR)双阻断法诱导细胞周期同步化,释放后在不同时间点收获蛋白样品,用Western Blot方法观察VASP及其磷酸化在细胞周期进程中水平的变化。　　 (5)通过胸苷(TDR)双阻断法诱导细胞同步化,分别用蛋白激酶A、G和C的抑制剂作用HeLa细胞,在不同时间点收获蛋白样品,用Western Blot方法,通过检测p-H3 S10高峰出现的时间,来观察细胞周期进程的变化。　　 (6)通过转染磷酸化位点突变的VASP质粒,改变细胞内VASP磷酸化水平,利用胸苷(TDR)双阻断法诱导细胞同步化,不同时间点收获蛋白样品,用Western Blot方法,通过检测p-H3 S10高峰出现的时间,来观察细胞周期进程的变化。　　 (7)利用RNAi干扰技术,敲除细胞内VASP蛋白,继而降低其磷酸化水平,利用免疫荧光方法,观察双核细胞计数的变化；利用流式细胞术,检测四倍体细胞数的变化；利用Western Blot方法,通过检测p-H3 S10高峰出现的时间来观察细胞周期进程的变化。　　 (8)构建靶向VASP基因的shRNA表达质粒,与GFP质粒共转染HeLa细胞,通过免疫荧光方法观察纺锤体形态的变化。　　 (9)利用非洲爪蟾卵提取物,通过抗体沉淀实验去除提取物中的VASP,观察纺锤体形成的变化。　　 研究结果:　　 (1)VASP与α-微管蛋白结合；p-VASP S157分布于有丝分裂细胞纺锤体,与α-微管蛋白结合；p-VASP S239与肌动蛋白共定位,与α-微管蛋白没有共定位关系。　　 (2)蛋白激酶A、G和C的抑制剂能够改变细胞内VASP磷酸化水平,引起p-H3 S10高峰出现延迟。　　 (3)VASP siRNA引起其磷酸化水平下降的吲时,导致双核细胞、四倍体细胞数增加,p-H3 S10高峰出现明显延迟。　　 (4)VASP siRNA引起HeLa细胞增殖抑制。　　 (5)靶向VASP基凶的shRNA表达质粒敲除细胞内VASP后,观察到形成的纺锤体形态正常。　　 (6)在爪蟾卵提取物体系中,敲除VASP蛋白后,观察到新形成的纺锤体形态异常。　　 由此得出以下结论:　　 (1)p-VASP S157定位于有丝分裂纺锤体,与α-微管蛋白共定位。　　 (2)VASP能够与α-微管蛋白结合,是一个新的微管相关蛋白。　　 (3)改变VASP磷酸化水平能够引起细胞周期G2/M的延迟。　　 (4)干扰细胞内VASP蛋白表达,引起细胞周期G2/M进程延迟、胞质分裂受阻和细胞生长抑制。　　 (5)VASP很町能在纺锤体组装过程中起着重要作用。