克服衰老一直是人类的最大梦想之一。机体衰老除了各器官组织结构和功能衰退,适应性和抵抗力降低以外,还会引发各种衰老相关的疾病,如糖尿病、帕金森症、阿尔茨默海氏症以及各种癌症等。目前对于衰老方面的通路研究,还有许多不明确的地方。SWI/SNF复合物是一类染色质重塑复合物家族蛋白,它由多个亚基构成,依赖ATP水解释放的能量来改变染色质结构,转录激活或转录抑制下游因子的表达。人类的SWI/SNF蛋白质家族在细胞周期的过程中发挥基础性的作用,如DNA复制,生长,分化,延伸,剪接以及DNA损伤的修复。近年来有研究发现,SWI/SNF复合物亚基,主要是催化亚基BRG1还参与调控细胞衰老过程,但对于其他亚基在衰老调控中的作用和相关机制还几乎没有具体研究。在本文中,我们采用浓度为150μM的过氧化氢处理人表皮永生化细胞HaCaT和人黑色素瘤细胞GLL19,处理时间为1小时,构建衰老模型,并在此模型基础上筛选衰老处理前后差异表达的SWI/SNF复合物亚基。然后分别在两种细胞中过表达和沉默筛选出的三个亚基,通过SA-β-gal染色、细胞增殖测定、细胞周期测定及衰老相关因子表达检测来探究SWI/SNF复合物亚基参与细胞衰老调控和可能的机制。为衰老相关通路研究及相关的临床治疗应用打下基础。主要实验结果如下:①用浓度为150μM的H2O2处理细胞1小时,然后继续培养4天,然后用形态学观察、SA-β-gal染色、MTT测定增殖和流式细胞术检测细胞周期来确认衰老表型。结果显示,H2O2处理4天后,细胞形态变得大而扁平,边界模糊,呈衰老样形态,SA-β-gal染色大部分呈阳性,细胞增殖明显受到抑制,细胞发生显著的G2期细胞周期阻滞。②用半定量RT-PCR的方法来筛选H2O2处理前后差异表达的SWI/SNF复合物亚基,并用Western Blot确认筛选出的亚基的在蛋白水平变化。结果显示:H2O2处理后,BAF57、BAF60a、SNF5和BRG1四个亚基基因水平表达上调,由于已有研究表明BRG1在细胞衰老中的作用,所以选取BAF57、BAF60a、SNF5进行进一步研究。Western Blot结果确认BAF57、BAF60a、SNF5在H2O2处理后蛋白水平表达上调。③在pcDNA-EGFP上构建过表达重组质粒pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5,将重组载体转入细胞中,并用半定量RT-PCR和Western Blot确认重组质粒成功转入细胞中并表达,然后用SA-β-gal染色、MTT测定增殖、流式细胞术检测细胞周期。结果显示:重组质粒构建成功,并且在细胞中高表达。转染了pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5的细胞SA-β-gal未见明显阳性染色,但是细胞增殖受到明显抑制,发生显著的S期细胞周期阻滞。表明BAF57、BAF60a、SNF5单独过表达并不能触发细胞衰老,但是会引起明显的细胞周期停滞。④siRNA转染沉默BAF57、BAF60a、SNF5的表达,再用H2O2处理,通过SA-β-gal染色和细胞周期测定来检测预先沉默三个亚基对H2O2处理诱导衰老的影响。结果表明:预先单独沉默BAF57、BAF60a、SNF5的表达后,SA-β-gal染色阳性细胞数目减少,细胞周期阻滞现象有所缓解。表明沉默三个亚基后,一部分细胞绕过了衰老途径。⑤用半定量RT-PCR对转染pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5后衰老相关因子进行检测,然后再用Western Blot检测沉默BAF57、BAF60a、SNF5,再用H2O2处理后细胞衰老相关因子的蛋白表达水平变化。结果表明:分别转染三个重组质粒后,衰老相关因子p53、p21、p16和pRB表达均有上调,Western Blot结果表明,沉默BAF57、BAF60a、SNF5,再用H2O2处理后,与仅H2O2处理组相比,p53、p21、p16和pRB都明显下调,初步确定BAF57、BAF60a、SNF5调控衰老涉及p53/p21和p16/pRB两条通路。