咖啡因具有几千年的使用历史,是世界范围内最普遍消费的活性食物成分。关于咖啡因广泛食用而产生的厌食作用,从而帮助人们维持或降低体重这一观点一直存在争议。而且目前对于咖啡因引起的厌食作用研究仅仅是从动物及人类对食物的认知及动机出发,对于其具体的机制尚不清楚。味觉是动物摄食行为的主要调节及驱动因子,咖啡因暴露后引起的厌食作用是否来自于味觉基础的变化尚未见报道。所以本研究结合近年来味觉感受机制、味觉感受影响因素和味觉可塑性等研究成果,提出了咖啡因长期暴露改变摄食行为以味觉外周感受器味蕾的变化为基础的假设。以ICR小鼠为动物模型,采用动物行为学、免疫组织化学、Western blot、实时荧光PCR及ELISA等多种方法相结合,探究了咖啡因长期暴露不同年龄段小鼠味觉行为改变与外周感受器即味蕾特征性变化(包括味蕾及味蕾细胞形态变化、味觉感受相关蛋白表达量变化)之间的相关性；同时延伸了咖啡因长期暴露作用,探讨了咖啡因长期暴露对小肠绒毛形态、甜味感受相关蛋白表达及肠道内葡萄糖吸收的影响；并且通过不同咖啡因刺激方式探讨了食物口腔感受及食物摄入后作用在味觉感受变化中的贡献。实验结果从多角度揭示了外周味觉感受器变化与咖啡因引起厌食作用的相关性,为咖啡因长期作用引起的厌食作用提供了味觉感受基础方面的理论依据。主要研究内容及结果如下：(1)咖啡因长期暴露改变小鼠味觉偏好不同年龄段正常组小鼠对咖啡因表现出不同的偏好模式,P24小鼠表现为典型的“冷漠-回避”模式,回避阈值为5.17 mmol/L;而P32及P49小鼠表现为典型的“冷漠-偏好-回避”,偏好阈值分别为0.92mmol/L和0.09 mmol/L,回避阈值分别为5.17 mmol/L和16.28mmol/L。与对照组小鼠性比,咖啡因暴露对不同年龄段小鼠咖啡因味觉偏好模式无影响,但增强各年龄段小鼠耐受性。青春前期及青春期小鼠表现为偏好率的增加,而青春期及成年小鼠还表现为偏好阈值的升高,偏好阈值分别为5.17 mmol/L和0.29 mmol/L。各个年龄段对照组及咖啡因暴露组小鼠具有相同的AK糖偏模式及最佳偏好浓度,表现为典型的“冷漠-偏好-回避”模式。但咖啡因长期暴露改变小鼠AK糖偏好阈值及偏好率,此作用具有刺激起始年龄差异性。与对照组小鼠相比,咖啡因暴露后降低青春前期小鼠AK偏好阈值,分别为1.33 mmol/L和0.42 mmol/L;而青春期及成年期刺激组小鼠表现为偏好阈值升高,均为0.42 mmol/L/1.33 mmol/L,偏好率降低,分别降低约6%和13.83%。总之上述结果表明不同年龄段小鼠咖啡因味觉偏好模式不同,为其他以咖啡因为研究对象的行为学研究提供了实验依据；其次本研究证明了咖啡因长期暴露后小鼠甜味偏好降低,为以小鼠为模型的咖啡因长期暴露引起可口食物厌腻感作用研究提供了行为学依据。(2)咖啡因长期暴露改变小鼠菌状味蕾解剖形态特征咖啡因长期暴露对舌面味蕾总数的影响无咖啡因暴露剂量差异性,除青春期500 mg/L对照组小鼠外,长期咖啡因暴露不改变小鼠舌面菌状味蕾总数,单个舌面味蕾数量基本位于100-110个之间。咖啡因长期暴露后各年龄段小鼠菌状味蕾最大横截面积虽无显著变化,横截面积基本位于1500-1600μm2之间,但与对照组小鼠相比,青春期及成年咖啡因刺激组小鼠菌状味蕾最大横截面呈明显减少趋势；同时味蕾纵轴高度也因咖啡因暴露而显著降低,与对照组小鼠相比,青春前期、青春期及成年激组小鼠味蕾高度分别降低13%/11%、13%/13%、13%/13%(300 mg/L/500 mg/L刺激组)；而且咖啡因长期暴露后单个味蕾中细胞总数也呈减少趋势,尤其是青春期及成年小鼠味蕾细胞总数显著减少,与对照组相比分别减少20%/14%、15%/8%(300mg/L/500 mg/L刺激组),而且具有显著的咖啡因暴露剂量差异性。综上所述咖啡因长期暴露通过减少味蕾最大横截面积、味蕾纵轴高度及单个味蕾中味细胞总数,综合减小味蕾体积,而且这种作用具有刺激起始年龄差异性,与青春前期小鼠相比,青春期及成年小鼠受咖啡因影响更大。而味蕾体积及味蕾细胞数量的减少可能导致味觉传入信息及味觉感受神经激活的降低,从而影响动物的饮食行为。(3)咖啡因长期暴露改变菌状味蕾甜味感受相关蛋白表达免疫荧光定量结果表明,长期咖啡因暴露显著降低所有年龄段小鼠单个菌状味蕾中α-gustducin阳性味细胞数,与对照组小鼠相比,500 mg/L咖啡因长期暴露后P24、P32及P49天雄性小鼠单个味蕾中α-gustducin阳性味蕾细胞数分别分别减少约22%、15%和23%,平均减少20%；与雌性小鼠相比,雄性小鼠受咖啡因影响程度更大(P<0.05),雌性P24/P32/P49天刺激组小鼠单个味蕾阳性味蕾细胞数分别减少15%、9%和16%,平均减少约13%,所以后期实验均采用雄性ICR小鼠为实验对象。与对照组小鼠相比,300 mg/L雄性P24/P32/P49天刺激组小鼠单个味蕾中α-gustducin阳性味细胞数分别减少约29%、33%和37%,平均减少33%,下降率显著高于500 mg/L刺激组小鼠(P<0.05),所以后期实验中均采用300 mg/L咖啡因暴露浓度。而且上述300 mg/L咖啡因长期暴露对α-gustducin表达影响通过Western Blot结果得到进一步证实,与对照组小鼠相比,P24,P32,P49三个年龄咖啡因刺激小鼠α-gustducin蛋白表达丰度分别降低约1.43、1.29和1.28倍。同时利用Western Blot技术对PLCP2、甜味受体T1R2/T1R3及SNAP25的表达丰度分析表明,与对照组小鼠相比,P24/P32/P49天咖啡因刺激组小鼠PLC(32也呈下调趋势,分别下调约1.35、1.41和1.08倍；但甜味受体蛋白T1R2/T1R3表达丰度呈上调趋势,分别上调3.28/2.18、3.29/1.94和2.55/2.05倍；而对SNAP25表达基本无影响。而且通过比较四种不同刺激物(咖啡因、奎宁、AK及蔗糖)长期暴露对小鼠味觉感受蛋白表达影响结果发现,咖啡因对各种味觉感受蛋白表达的影响具有特异性。总之咖啡因长期暴露影响味觉信号转导蛋白a-gustducin(减少)、PLCβ2(减少)、甜味受体蛋白T1R2/T1R3(增加)表达。而且这些影响具有性别及暴露剂量差异性,雄性受影响程度更大,低剂量咖啡因暴露作用更大。综合以上三部分实验结果表明咖啡因长期暴露改变不同年龄段小鼠外周味觉感受器-味蕾解剖形态(包括减少味蕾最大横截面及纵轴高度,单个味蕾中味细胞总数),同时伴随有味觉感受相关蛋白α-gustducin、PLCβ2表达丰度降低,甜味受体蛋白T1R2/T1R3表达丰度增加,而这些结构与功能的变化可能是咖啡因长期暴露降低甜味偏好的味觉基础。(4)咖啡因长期暴露改变小肠不同区域甜味感受相关蛋白表达及肠道内葡萄糖耐受性长期咖啡因暴露显著增加小鼠小肠各部分绒毛高度,与对照组小鼠相比,刺激组小鼠十二指肠、中间段空肠及回肠小肠绒毛高度分别增长约8%、6%及3%；而对隐窝深度的影响恰好相反,刺激组小鼠十二指肠、中间段空肠及回肠隐窝的深度分别减少约7%、3%及7%。综合以上结果,咖啡因暴露组小鼠各段小肠绒毛绒腺比显著增加,分别增加约9%、9%和10%。免疫共定位结果表明α-gustducin与甜味受体蛋白T1R2/T1R3存在小肠各个部分,而且彼此存在共表达。而Western Blot对上述蛋白表达进行定量分析表明,与对照组小鼠相比,十二指肠、空肠及回肠中甜味受体蛋白T1R2/T1R3表达丰度均显著呈增加趋势,分别上调2.38/1.74倍、1.61/2.17倍和1.71/2.30倍；而α-gustducin表达丰度在十二指肠中呈下降趋势,空肠及回肠中无显著变化；咖啡因长期暴露基本不改变下SNAP25在各段小肠中表达。根据甜味受体及α-gustducin在肠道甜味感受、餐后GLP-1等其他肠道激素分泌调节的中作用及我们的研究结果,对禁食葡萄糖灌胃后血浆中GLP-1及胰岛素释放及葡萄糖耐受性进行分析,结果表明与对照组小鼠相比,咖啡因刺激小鼠对葡萄糖存在更高的GLP-1及胰岛素分泌,同时受到咖啡因长期暴露的影响,刺激组小鼠葡萄糖耐受性显著增强。综上所述咖啡因长期暴露显著增加小肠绒毛高度,上调小鼠各部分小肠甜味受体蛋白T1R2/T1R3表达丰度,改变肠道内甜味感受生物学基础；另外咖啡因长期暴露增强GLP-1及胰岛素对肠道内葡萄糖存在的响应,同时也改变了肠道内葡萄糖动态平衡；但是关于这些改变的相关性还有待于进一步实验的深入探究。(5)咖啡因口后摄入作用对口腔味觉感受器特征改变的贡献利用口后灌胃与口腔自由饮用咖啡因溶液方式分析咖啡因摄入后作用对味觉外周感受器味蕾特征改变贡献的结果表明,两种激方式均改变菌状味蕾特征性,包括味蕾纵轴高度降低、单个味蕾中味细胞数量及α-gustducin阳性细胞数减少,α-gustducin表达丰度降低,甜味受体蛋白T1R2/T1R3表达丰度增加,但咖啡因口后灌胃作用小于口腔自由饮用咖啡因溶液暴露方式。表明咖啡因摄入后作用,对于味觉外周感受器味蕾特征性改变可能具有重要贡献作用。